龔正媛，張瀶曦，尹雅琪，鄒俊彥，于松巖，李 冰，薛 婧，程 愈，母義明

解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100853

糖尿病是心血管疾病、慢性腎疾病、失明和截肢的主要原因之一[1]。傳統(tǒng)降糖藥物在一定程度上能夠控制血糖、延緩并發(fā)癥的出現(xiàn)，但無法從根本上遏制糖尿病的病理生理進程和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[2]。因此，研發(fā)能從根本上改善糖尿病、遏制糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的新方法是當(dāng)前糖尿病治療研究的重點。間充質(zhì)干細胞是一類具有低免疫源性、自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，其主要來源有脂肪、骨髓、臍帶等組織，自發(fā)現(xiàn)以來廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究[3-4]。已有大量研究報道，間充質(zhì)干細胞的輸注能降低血糖，改善胰島素抵抗，降低糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險[5-7]，但其具體機制仍不十分清楚。為進一步探索間充質(zhì)干細胞改善糖尿病并發(fā)癥的機制，本文運用CM-Dil染料對UC-MSCs進行染色定位示蹤，了解間充質(zhì)干細胞輸注到糖尿病大鼠體內(nèi)后在各個臟器中的歸巢情況。

材料和方法

1 材料 30只8周齡雄性SD大鼠(SPF級)，體質(zhì)量200 ～ 220 g，購自解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：11400700238064；鏈脲佐菌素(STZ)和DAPI核染料購自Sigma公司；CMDil購自Invitrogen公司；血糖儀購自強生公司；包埋劑(OCT)購自SAKURA公司；高脂飼料(high fat diet，HFD，D12492)購自Research Diets公司；山羊封閉血清、抗體稀釋液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自百奧生物公司；無血清培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司。

2 2型糖尿病模型建立和分組 30只8周齡雄性SD大鼠隨機抽取10只給予普通動物飼料飼養(yǎng)，其余大鼠則給予高脂飼料，每2周稱重1次。8周后高脂飼養(yǎng)的大鼠禁食不禁水12 h后稱重。將STZ按照25 mg/kg的劑量進行腹膜內(nèi)注射，隔日檢測尾靜脈隨機血糖。連續(xù)3 d隨機血糖≥16.7 mmol/L視為2型糖尿病造模成功[8]。造模過程中無大鼠死亡，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周。將造模成功的大鼠隨機分為糖尿病組(DM組，n=10)和UC-MSCs治療組(MSC組，n=10)，普通飼料飼養(yǎng)大鼠設(shè)為正常對照組(N組，n=10)。以上所有操作均符合實驗動物保護法。

3 MSCs的分離、培養(yǎng)和表型鑒定 無菌條件下采集于解放軍總醫(yī)院行剖宮產(chǎn)足月胎兒的臍帶，并簽署知情同意書。臍帶用PBS充分洗滌，去除殘留血液、臍帶外膜組織和血管組織，得到臍帶Wharton膠組織并剪碎，于37℃溫度下用0.1%Ⅳ型膠原酶消化18 h后經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1 000 r/min離心，獲得細胞沉淀用10ml培養(yǎng)基重懸接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至接近85%融合時，消化細胞并以1∶3比例接種到新的培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)，傳至第4代時備用。取生長至85%融合的第4代細胞，消化洗滌后分別加入流式抗體 CD45-FITC、CD90-FITC和 CD105-PE， 相 應(yīng)的人IgG作同型對照，使用流式細胞儀檢測UCMSCs免疫表型。取生長至85%融合的第4代細胞接種于6孔板，利用向脂肪細胞及骨細胞定向分化的培養(yǎng)基誘導(dǎo)UC-MSCs定向分化，并分別采用油紅O和茜素紅染色進行鑒定[8-9]。

4 UC-MSCs輸注治療 第4代UC-MSCs融合至70% ～ 80%，經(jīng)0.25%胰酶進行消化，每3×106UC-MSCs細胞重懸于0.5 ml PBS中，通過尾靜脈輸注到MSC組大鼠體內(nèi)，DM組和N組則尾靜脈輸注等量PBS，每2周輸注1次，共輸注4次。

5 檢測指標 每次治療后1周測體質(zhì)量、血糖(所有隨機血糖監(jiān)測均于下午15：00 - 16：00進行)，治療前、中、后各測定1次尿蛋白，處死前進行IPGTT實驗。腎小球硬化表現(xiàn)為毛細血管腔塌陷和(或)玻璃樣變，腎小球硬化程度評分采用Raij等[10]的半定量法計算腎小球硬化指數(shù)。

6 UC-MSCs的CM-Dil染色及Dil-MSCs輸注CM-Dil粉末離心后加入40μl DMSO試劑溶解備用。第4代UC-MSCs融合至70% ～ 80%進行消化，每1×106UC-MSCs細胞用1 ml PBS重懸，并加入1μl配好的CM-Dil進行標記，于37℃避光孵育5 min，4℃孵育15 min后以1 000 r/min速度離心5 min，去上清液，洗滌過程重復(fù)2次，細胞沉淀以每3×106用0.5 ml PBS重懸，在第4次干細胞治療后2周，每組隨機抽取3只大鼠進行Dil-MSCs輸注，輸注細胞量均為3×106/只。

7 HE染色及示蹤 Dil-MSCs移植后72 h處死所有大鼠，取胰腺、腎、肝和脾。Dil-MSCs移植大鼠所取組織制作連續(xù)冷凍切片后觀察各組織UCMSCs細胞數(shù)，非Dil-MSCs移植鼠組織制作石蠟切片，行HE染色。

8 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 UC-MSCs輸注治療后大鼠體質(zhì)量、血糖、糖耐量變化 UC-MSCs第1次輸注后1周MSC組大鼠隨機血糖無明顯變化，治療2次后血糖逐漸降低，治療4次后MSC組血糖水平為(23.9±3.7) mmol/L(n=10)，N 組血糖水平為 (8.3±1.4) mmol/L(n=10)，DM組血糖維持在(28.2±2.9) mmol/L(n=10)(圖1A)。N組大鼠平均體質(zhì)量約為695 g，DM組大鼠平均體質(zhì)量約為582 g，MSC組大鼠平均體質(zhì)量約為599 g，MSC組與DM組相較于N組均表現(xiàn)為消瘦(P＜0.01)，但與DM組相比UC-MSCs多次輸注對糖尿病大鼠的消瘦狀態(tài)有所改善(P＜0.01，圖1B)。IPGTT實驗結(jié)果顯示，腹腔注射葡萄糖前，DM組空腹血糖為15.4±1.2 mmol/L，MSC組空腹血糖為13.8±0.8 mmol/L(P＜0.01)。葡萄糖注射30 min時，兩組血糖分別為32.5±4.0 mmol/L和28.2±2.3 mol/L(P＜0.01)；60 min時，兩組血糖分別為33.2±3.0 mmol/L和28.6±2.3 mmol/L(P＜0.01)；90 min時，兩組血糖分別為31.5±2.8 mmol/L和28.4±1.6 mmol/L(P＜0.01)；120 min時，兩組血糖分別為31±2.3 mmol/L和25.7±1.1 mmol/L(P＜0.01)，IPGTT實驗結(jié)果顯示任何時間點MSC組血糖均明顯低于T2DM組(P＜0.01，圖1C)。

2 各組腎病理改變及干細胞歸巢情況 HE染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，DM組出現(xiàn)明顯的腎小球硬化，而多次UC-MSCs治療降低了糖尿病大鼠的腎小球硬化程度(圖2A，圖2C)。CM-Dil標記干細胞示蹤結(jié)果顯示，在輸注干細胞72 h后，只有少量UC-MSCs到達腎，其中DM組到達腎的UC-MSCs較N組和MSC組多(P＜0.05)。

3 各組肝病理改變及干細胞歸巢情況 HE染色觀察肝組織發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，DM組出現(xiàn)明顯的脂肪肝，細胞內(nèi)可看到明顯的脂滴聚集；MSC組的肝細胞形態(tài)雖然較N組肥大，但細胞內(nèi)未出現(xiàn)明顯的脂滴聚集(圖3A)。CM-Dil標記干細胞示蹤結(jié)果顯示，在輸注干細胞72 h后，只有少量UC-MSCs到達肝，其中DM組到達肝的UC-MSCs較N組和MSC組多(P＜0.05，圖3B，圖3C)。

4 各組胰腺病理改變及干細胞歸巢情況 HE染色觀察胰腺組織結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與N組相比DM組出現(xiàn)明顯的胰島皺縮，4次UC-MSCs治療使MSC組該現(xiàn)象明顯改善(圖4A)。CM-Dil-MSC輸注后72 h并未觀察到干細胞歸巢至胰腺組織(圖4B)。

5 各組脾干細胞歸巢情況 脾臟中發(fā)現(xiàn)大量UCMSCs的歸巢，主要分布于紅髓和邊緣區(qū)，且各組歸巢干細胞數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異(圖5A，圖5B)。

討 論

圖1 多次UC-MSCs輸注對糖尿病大鼠隨機血糖、體質(zhì)量及糖耐量的影響(MSC組vs DM組，aP＜0.05, bP＜0.01)Fig. 1 Effect of UC-MSCs on blood glucose level (A) and body weight (B) as well as glucose tolerance (C) in diabetic rats (MSC group vs DM group, aP＜0.05, bP＜0.01)

圖2 大鼠腎HE染色及示蹤結(jié)果(aP＜0.05, vs N組,bP＜0.01, vs DM組。圖A，比例尺=20μm；圖B，比例尺=100μm)Fig. 2 Results of HE staining and UCMSCs homing in kidney (aP＜0.05, vs N group，bP＜0.05, vs DM group. Scale bar in panel A:20μm; B: 100μm)

圖3 大鼠肝HE染色及示蹤結(jié)果 (aP＜0.05, vs N組, bP＜0.05, vs DM組。圖A，比例尺=20μm；圖B，比例尺=100μm)Fig. 3 Results of HE staining and UC-MSCs homing in liver (aP＜0.05, vs N group, bP＜0.05, vs DM group. Scale Bar in panel A: 20μm; B:100μm)

圖4 大鼠胰腺HE染色及示蹤結(jié)果(圖A，比例尺=20μm；圖B，比例尺=100μm)Fig. 4 Results of HE staining and UC-MSCs homing in pancreas (scale Bar in panel A: 20μm; B: 100μm)

圖5 大鼠脾干細胞示蹤結(jié)果(NS表示各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義， A圖比例尺=100μm)Fig. 5 Results of UC-MSCs homing in the spleen (NS=no significant difference, scale bar in panel A :100μm)

截至2017年全球約有4.25億人患有糖尿病[11]。持續(xù)性高血糖與長期代謝異?？蓪?dǎo)致全身組織器官功能障礙甚至衰竭，常見糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病足、糖尿病心肌病、糖尿病骨病等[12]?，F(xiàn)有的治療方案可以控制血糖或暫時改善靶組織中的胰島素敏感性，但無法逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗和進行性的B細胞功能障礙[8]。間充質(zhì)干細胞是一類能夠分化成間充質(zhì)譜系的多能細胞，可以從多種組織中分離出來，并且易于在體外進行擴增培養(yǎng)[13]。Zhu等[14]發(fā)現(xiàn)在對雄性新西蘭兔進行局灶性腦缺血造模后立即注射人臍帶血間充質(zhì)干細胞能顯著抑制炎性細胞的浸潤，增加缺血區(qū)域周圍的神經(jīng)元密度，降低缺血區(qū)域周圍細胞凋亡的百分比。而Cheng等[15]在臨床研究中證明了UC-MSCs移植可有效改善脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，其療效遠優(yōu)于康復(fù)治療和自愈。在糖尿病治療方面，Gao和Lee等[16-17]的文章中提及MSCs可以促進胰島B細胞的再生，保護內(nèi)源性胰島B細胞免于凋亡，從而改善機體高血糖狀態(tài)。Davey等[5]的綜述中總結(jié)了一些干細胞治療糖尿病并發(fā)癥的相關(guān)研究，但是這些研究中的疾病模型病程較短，干預(yù)手段多為單次注射治療，且較少涉及具體機制的探索。

本研究結(jié)果顯示，多次UC-MSCs輸注治療后，相較于DM組，MSC組血糖明顯降低，糖耐量水平及消瘦狀態(tài)改善，腎小球硬化及脂肪肝程度有所減輕，同時胰腺的病理狀態(tài)得到改善，表明多次輸注UC-MSCs對2型糖尿病大鼠有一定的治療作用。

通過對干細胞進行CM-Dil染色標記示蹤發(fā)現(xiàn)，DM組肝和腎中的干細胞數(shù)目多于N組和MSC組(P＜0.05)。有研究報道，受損組織可以表達特定的炎癥介質(zhì)以促進MSCs遷移、浸潤到損傷部位，這一過程中信號通路如CX3CL1-CX3CR1、CXCL12-CXCR4和CCL2-CCR2起到重要作用[18-19]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示MSCs有一定趨化性，且該趨化性與組織損傷密切相關(guān)。但總體而言，歸巢于肝、腎、胰腺的UC-MSCs數(shù)量極其有限，依靠歸巢干細胞的局部效應(yīng)可能難以發(fā)揮如此明顯的治療效應(yīng)，由此提示UC-MSCs對2型糖尿病的治療作用可能更多地依賴于其他方式。有研究報道MSCs能夠分化成胰島素分泌細胞，以葡萄糖依賴性的方式釋放胰島素，從而改善糖尿病癥狀[20-21]。但Davey等[5]認為這種可能性較小，MSCs可能更多地通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子阻止內(nèi)源性T細胞對B細胞的破壞間接發(fā)揮作用。結(jié)合以上研究我們推測，在本研究中，對于該2型糖尿病大鼠長期病程模型，多次輸注的UC-MSCs可能是通過分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)免疫繼而發(fā)揮治療作用。

此外，本研究還觀察到大量UC-MSCs歸巢于脾，且三組脾中歸巢干細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與脾的儲血、濾血等功能有關(guān)。最近一項關(guān)于脾在脂肪間充質(zhì)干細胞治療T2D中的作用的研究顯示，脾切除會導(dǎo)致間充質(zhì)干細胞的治療效果顯著降低，加劇高血糖和胰島素抵抗[22]。有研究報道脾能夠參與炎癥反應(yīng)，如Gotoh等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，脾切除術(shù)會導(dǎo)致下丘腦、肝和白色脂肪組織的炎癥反應(yīng)加重，而這些改變會被外源性IL-10所逆轉(zhuǎn)。在IL-10缺乏癥中，脾切除對這些多器官中的炎癥反應(yīng)幾乎沒有影響，表明脾參與炎癥反應(yīng)可能主要依賴于IL-10。結(jié)合本文研究結(jié)果我們推測，在UC-MSCs對T2D的治療過程中，脾可能起到重要作用，而且IL-10很可能擔(dān)任關(guān)鍵角色，但具體機制有待進一步探索。