董周寰，石懷銀，呂亞莉，鐘 梅，朱鳳偉

解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 100853

KRAS是人類腫瘤細(xì)胞中最早發(fā)現(xiàn)突變的基因之一[1]，屬于RAS基因家族(KRAS、NRAS、HRAS)的一員，編碼鳥苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白(guanosine-5'-triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白[2]。KRAS是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路下游的一個(gè)重要的調(diào)控基因，突變型KRAS可跳過EGFR接收信號，持續(xù)激活下游通路，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。因此，KRAS基因突變是anti-EGFR單抗藥物的不敏感預(yù)測因子。美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南都建議在使用EGFR單抗藥物之前檢測腫瘤KRAS基因的突變狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道，KRAS基因突變在結(jié)直腸癌中發(fā)生率為20% ～ 50%[2-4]。其中85% ～ 90%的突變都發(fā)生于外顯子2的12和13號密碼子 (KRAS exon 2 G12/13)[2]。KRAS基因突變使得結(jié)直腸癌患者不能從anti-EGFR藥物受益。目前研究表明，有多條腫瘤相關(guān)信號通路及其基因分別或同時(shí)調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,5]，但與其他不同信號通路的腫瘤相關(guān)基因不相互排斥[6]。KRAS基因突變患者的其他腫瘤相關(guān)基因的突變特征(突變頻率、突變熱點(diǎn)分布、與臨床病理相關(guān)性等)還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分析KRAS突變陽性的結(jié)直腸癌中國人群中腫瘤相關(guān)基因的體細(xì)胞突變頻率，探討KRAS基因與其他腫瘤相關(guān)基因的共突變現(xiàn)象和相關(guān)性，為KRAS基因耐藥機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)積累，也為個(gè)體化治療和預(yù)后判斷提供幫助。

材料和方法

1 樣本采集 收集2015年1月- 2016年9月本院初診的結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本163例。按照常規(guī)方法甲醛固定，做成石蠟包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded)樣本，用石蠟切片機(jī)切成3μm的薄片并黏附在載玻片上，然后對其進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。染色后的病理切片由病理醫(yī)師復(fù)閱診斷，挑選出腫瘤細(xì)胞≥20%的樣本。

2 FFPE樣本的DNA抽提 FFPE樣本進(jìn)行10 μm常規(guī)切片，每個(gè)樣本制作10張白片。用無菌刀片將腫瘤組織刮取到潔凈的1.5 ml離心管中，按照QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(Qiagen，德國)進(jìn)行基因組DNA抽提。主要步驟：二甲苯溶液脫蠟處理，裂解液加蛋白酶K裂解樣本，高溫逆轉(zhuǎn)分子交聯(lián)，吸附柱核酸吸附，洗滌，最后用40μl TE溶液將DNA從膜上洗脫下來。用Qubit 3.0熒光定量儀(Thermo scientific，美國)檢測抽提的基因組DNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA的片段大小。濃度在2ng/μl以上，片段大小在500 bp以上即為DNA合格。

3 PCR擴(kuò)增及一代測序 針對KRAS基因最常見的突變G12/13所在的2號外顯子，設(shè)計(jì)上游引物：5'-ATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTG-3'，下游引物：5'-CAATTTAAACCCACCTATAATGGT-3'。質(zhì)檢合格的DNA樣本首先進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系 ：2.5μl PCR buffer，Mix 引物 2μl，dNTP 2μl，10 ng DNA，Taq酶0.5μl，去離子水補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 7 min；變性95℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，循環(huán)35次；最后終延伸72℃ 7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶清晰片段大小合理，則可進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化和測序。測序反應(yīng)體系20 μl：純化的PCR 產(chǎn)物 1 μl，2.5×BigDye 8μl，引物 1μl，去離子水10μl。反應(yīng)條件：96℃ 1 min；變性96℃10 s，退火50℃ 5 s，延伸60℃ 4 min，循環(huán)25次。測序產(chǎn)物純化后，在ABI 3730xl基因測序儀(Thermo scientific，美國)上進(jìn)行雙向測序及分析。對這些樣本進(jìn)行一代測序檢測后，挑選出其中50例KRAS G12/13突變陽性的樣本再進(jìn)行后續(xù)檢測。

4 二代測序及分析 經(jīng)檢測KRAS G12/13突變陽性的DNA樣本進(jìn)行多基因檢測。所檢測的基因panel包括腫瘤靶向藥物相關(guān)，常見抑癌基因，以及其他常見腫瘤相關(guān)突變共59個(gè)基因6 000多個(gè)熱點(diǎn)突變。相關(guān)基因：ABL1，AKT1，ALK，APC，ATM，BRAF，CBL，CDH1，CDK4，CDKN2A，CHEK2，CSF1R，CTNNB1，DNMT3A，EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4，EZH2，F(xiàn)BXW7，F(xiàn)GFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)LT3，GNA11，GANS，HNF1A，HRAS，IDH2，JAK1，JAK2，JAK3，KDR，KIT，KRAS，MET，MLH1，MPL，NFE2L2，NOTCH1，NPM1，NRAS，PAX5，PDGFRA，PIK3CA，PPP2R1A，PTCH1，PTEN，RAF1，RB1，RET，SF3B1，SMAD4，SMARCB1，SMO，STAT3，STK11，TP53，U2AF1，VHL。 其中 APC、TP53、KRAS、PIK3CA、BRAF五 個(gè) 基因在COSMIC數(shù)據(jù)庫中記錄的突變頻率超過10%。二代測序(next generation sequence，NGS)實(shí)驗(yàn)操作參考OncoAimTM腫瘤多基因突變與藥物代謝檢測試劑盒(Singlera Genomics Inc. Shanghai，China)說明書，主要步驟：取20 ng DNA結(jié)合試劑盒中的特異擴(kuò)增子進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，經(jīng)過去除擴(kuò)增引物、末端修復(fù)、添加接頭、連接產(chǎn)物純化、文庫擴(kuò)增和純化后，Qubit 3.0定量儀檢測樣本文庫濃度為 2 ～ 15 ng/μl，空白對照文庫濃度低于 1 ng/μl，LabChip QC檢測文庫主條帶在225 bp，則文庫構(gòu)建完成。采用Illumina MiSeq平臺對純化后的文庫進(jìn)行高通量測序，測序模式設(shè)置為雙端測序，2×150 bp。測序完成后，采用bcl2fastq命令將原始的bcl文件轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)的fastq格式文件。采用Fastqc對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，去除接頭序列和低質(zhì)量序列，比對參考基因組，并對序列文件進(jìn)行排序。通過GATK對變異位點(diǎn)質(zhì)量進(jìn)行校正，獲取SNP和InDel信息，并對其進(jìn)行左對齊處理，最終生成VCF文件以存儲變異位點(diǎn)信息，最后根據(jù)通用數(shù)據(jù)庫對檢測得到的變異位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋并生成報(bào)告。

5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 樣本選擇及臨床病理特征 根據(jù)一代測序結(jié)果共入組50例KRAS exon2 G12/13突變陽性的結(jié)直腸癌樣本，其中G12突變42例，G13突變8例。除3例樣本的腫瘤細(xì)胞含量為20%以外，其余47例樣本的腫瘤含量均為30%以上。其他臨床信息見表1。

2 NGS數(shù)據(jù)質(zhì)量 50例樣本有效測序深度最低790×，最高1 307×；數(shù)據(jù)覆蓋度均一性均＞90%(92.9% ～ 98.5%)。根據(jù)突變頻率≥5%，覆蓋度≥30，變異等位基因數(shù)≥10進(jìn)行變異位點(diǎn)篩選。所有樣本均檢測到KRAS突變，且KRAS exon2的突變與一代測序結(jié)果完全一致，表明本研究的NGS測序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。本研究的50例樣本中，有48例樣本檢測到了KRAS以外的基因突變，包括核苷酸堿基替換和插入缺失突變，有兩個(gè)樣本未檢測到KRAS以外的基因突變。單個(gè)樣本的基因突變數(shù)目不多，僅1例樣本有5個(gè)KRAS以外的突變位點(diǎn)，其余樣本檢測到1 ～ 3個(gè)突變位點(diǎn)(圖1A)。

3 樣本基因突變比率 檢測的59個(gè)基因中，有13個(gè)基因檢測到至少1次突變(表2，圖1B)。除KRAS基因外，本研究中突變樣本數(shù)超過10%(5例 以 上 )的 基 因 有 TP53(31例，62%)、APC(23例，46%)、PIK3CA(11例，22%)和 SMAD4(7例，14%)。有2個(gè)樣本檢測到TP53發(fā)生了2個(gè)突變；有2個(gè)樣本檢測到APC發(fā)生了2個(gè)突變。其余12個(gè)基因在1個(gè)樣本中僅檢測到1個(gè)突變。另外，同 為 RAS家 族 的 HRAS、NRAS、HRAS， 以 及COSMIC數(shù)據(jù)庫中突變頻率超過10%的BRAF基因，均未檢測到突變。

4 基因突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì) 除KRAS基因外，發(fā)生突變的12個(gè)基因一共檢測到65種不同突變，絕大多數(shù)突變在這50例樣本中僅出現(xiàn)1 ～ 2次。APC R1450*、APC T1556fs*3、SMAD4 R361C/H各出現(xiàn)了5次；TP53 G245S、PIK3CA H1047R各出現(xiàn)了4次； TP53 R175H出現(xiàn)了3次。50例樣本一共檢測到11個(gè)PIK3CA突變，其中5個(gè)(45.5%)發(fā)生在exon 20(4個(gè)H1047R，1個(gè)Y1021C)，3個(gè)(27.3%)發(fā)生在exon 9(2個(gè)E545K，1個(gè)Q546K)，3個(gè)(27.3%)發(fā)生在其他外顯子區(qū)域(C420R，N345K，K111E)。沒有檢測到同時(shí)發(fā)生兩個(gè)PIK3CA突變的樣本。

5 基因突變與臨床的相關(guān)性 本研究所檢測到的基因突變數(shù)與入組患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤分化程度均無相關(guān)性。除KRAS基因外，突變頻率高于10%的4個(gè)基因TP53、APC、PIK3CA和SMAD4與入組患者臨床信息的相關(guān)性見表1。以上4個(gè)基因在不同腫瘤發(fā)生位置的突變分布存在差異(圖2A)。結(jié)腸癌(包括左半結(jié)腸、右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、直乙交界)患者突變頻率最高的基因是TP53(27/36，75%)，其次為APC基因(15/36，41.7%)，左右半結(jié)腸以及橫結(jié)腸之間的基因突變分布一致；而在直腸癌患者中，突變頻率最高的是APC基因(8/14，57.1%)，TP53基因在直腸癌患者中的突變頻率(4/14，28.6%)顯著低于結(jié)腸癌患者(P=0.002，表1，圖2B)。

圖1 KRAS突變陽性的結(jié)直腸癌患者腫瘤相關(guān)基因突變分布 A：樣本的基因突變數(shù)量分布； B:腫瘤相關(guān)基因突變次數(shù)分布Fig. 1 Mutation distribution of tumor-related genes in patients with KRAS mutation and positive colorectal cancer A: Quantitative distribution of gene mutations; B: The number of mutations of tumor-related genes detected

圖2 腫瘤相關(guān)基因在結(jié)直腸癌不同發(fā)生部位的分布 A： TP53、APC、PIK3CA和SMAD4在不同腫瘤發(fā)生位置的突變頻率； B：TP53在結(jié)腸癌和直腸癌的突變頻率Fig. 2 Distribution of tumor-related genes in different sites of colorectal cancer A: Mutation frequencies of TP53,APC, PIK3CA and SMAD4 gene in different tumor locations; B: Mutation frequency of TP53 in colon and rectal cancer

表1 結(jié)直腸癌腫瘤組織中高頻突變基因與臨床特征的關(guān)系Tab. 1 Relationship between high frequency mutation gene and clinical features in colorectal cancer tissue

表2 基因突變數(shù)量分布Tab. 2 Gene mutation quantity distribution

討 論

本研究所用的樣本均為保存1 ～ 2年的FFPE樣本。這類樣本在制作和存儲過程中，DNA容易發(fā)生降解和損傷，導(dǎo)致測序質(zhì)量下降甚至測序失敗。本項(xiàng)目50例FFPE樣本均能成功建庫并上機(jī)測序，所得的下機(jī)數(shù)據(jù)覆蓋度高，均一性好，質(zhì)量可靠。其中對KRAS基因的測序結(jié)果與一代測序檢測的結(jié)果一致，表明本研究所用的檢測方法準(zhǔn)確性高，結(jié)果真實(shí)可信。

超過一半的結(jié)直腸癌患者有RAS家族(KRAS、NRAS、HRAS)或者BRAF突變，且這些突變互相排斥[7]。本研究全部50例KRAS exon2 G12/13突變陽性患者，同樣未檢測到NRAS、HRAS、BRAF的突變。本研究也未檢測到腫瘤中常見的EGFR突變，支持KRAS與EGFR一般不存在共突變的結(jié)論[5]。

TP53是重要的抑癌基因，TP53突變是人類腫瘤發(fā)病的主要因素之一。本研究中TP53基因是除KRAS基因外突變次數(shù)最多的基因，突變頻率(62%)與其他研究結(jié)果較為接近(30% ～ 70%)[2]，支持TP53突變與KRAS突變受不同的信號通路影響[8]。檢測到的TP53發(fā)生在外顯子4 ～ 8，其中突變次數(shù)最多的兩個(gè)熱點(diǎn)G245S、R175H均在該基因突變較為集中的結(jié)構(gòu)熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)[9]，將影響細(xì)胞生長、凋亡的調(diào)控，以及DNA修復(fù)功能。此外，本研究中TP53在結(jié)腸癌中的突變頻率(75%)顯著高于直腸癌(28.6%)，即結(jié)腸癌比直腸癌存在更多的KRAS、TP53的共突變現(xiàn)象。

腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因是結(jié)直腸癌相關(guān)研究中廣泛報(bào)道的高頻率突變基因[10]，檢測到其突變頻率為46%，與其他中國人群結(jié)直腸癌中的研究結(jié)果(突變頻率為30%左右[11-12])相近，略低于國外的一些報(bào)道(50% ～ 80%[12-13])。結(jié)直腸癌中APC基因的兩個(gè)體細(xì)胞突變熱點(diǎn)密碼子1309和1450，均在本研究的樣本中被檢測到。其中R1450*被檢測到5次(10%)，是本研究中發(fā)生突變次數(shù)最多的位點(diǎn)之一；而E1309fs*4僅被檢測到1次。另一個(gè)突變位點(diǎn)T1556fs*3也發(fā)生了5次突變(10%)，而這個(gè)位點(diǎn)在別的研究中報(bào)道較少[14]，說明這個(gè)位點(diǎn)可能與KRAS存在一定的相關(guān)性。

我們檢測到11例樣本(22%)發(fā)生了PIK3CA突變，與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致。突變主要存在于exon 20和exon 9。本次檢測到的PIK3CA突變頻率與以往的報(bào)道相近 (14.5%[6]，10% ～ 18%[7]，32%[16])，但不支持之前報(bào)道的PIK3CA與KRAS的正相關(guān)關(guān)系[6-7]?？赡艿脑蚴桥cKRAS G2/13突變存在正相關(guān)關(guān)系的是PIK3CA exon 9的突變，而本研究樣本量較少，exon 9突變僅3例樣本，還不能看出差異。在exon 9和exon 20檢測到3個(gè)突變位點(diǎn)都是報(bào)道過的突變熱點(diǎn)(hotspots)[17]，尤其是位于exon 20的H1047R位點(diǎn)在4例樣本(8%)中被檢測到。

SMAD4是重要的腫瘤抑制基因。SMAD4在48%的胰腺癌中都有突變，在包括其他腫瘤中突變頻率均＜10%[18-19]。而在結(jié)直腸癌中僅約6%檢測到突變[19]。本研究檢測到7例樣本(14%)發(fā)生了SMAD4突變，且其中5例(10%)發(fā)生在密碼子361。R361是SMAD4突變熱點(diǎn)之一，位于識別蛋白形成R-SMADS復(fù)合體的蛋白環(huán)區(qū)域[20-21]。R361C/H是本研究中發(fā)生突變次數(shù)最多的位點(diǎn)之一，提示SMAD4及其R361突變與KRAS存在一定的相關(guān)性，我們還需要入組更多SMAD4突變陽性的樣本加以證實(shí)。

綜上所述，在KRAS突變陽性的結(jié)直腸癌組織樣本中，檢測到較多突變的這些基因的突變頻率或者突變熱點(diǎn)分布，與以往報(bào)道的整體的結(jié)直腸癌組織樣本中的分布存在差異。表明這些基因或熱點(diǎn)的突變與KRAS及其通路存在一定的相關(guān)性。在對KRAS突變陽性的結(jié)直腸癌進(jìn)行選擇藥物干預(yù)方案時(shí)，需要綜合考慮其他基因的突變情況，有利于為患者提供更有效的治療。