高樹(shù)峰 張克輝 游龍貴 劉遺斌 羅冬 黃振河 王心濤

[摘要]目的 探討鈣網(wǎng)蛋白（CRT）在人喉癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白印記（Western blot）檢測(cè)CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化。結(jié)果 喉癌組織CRT的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），CRT mRNA表達(dá)升高67%，CRT蛋白表達(dá)升高71%。結(jié)論 CRT可能參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，CRT可能是喉癌一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]鈣網(wǎng)蛋白；喉癌細(xì)胞；臨床意義

[中圖分類號(hào)] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）12（a）-0026-04

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以40～60歲男性多見(jiàn)，近年來(lái)發(fā)病率有明顯增高的趨勢(shì)，其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，具體的疾病發(fā)生機(jī)制尚未完全知悉，多數(shù)研究顯示腫瘤細(xì)胞的凋亡受阻可能與其疾病的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）為細(xì)胞表面的一種重要標(biāo)志物，研究顯示，其在許多惡性腫瘤中均有表達(dá)狀態(tài)，且在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。本研究應(yīng)用熒光定量PCR（RT-PCR）、蛋白印記（Western blot）檢測(cè)CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化，探討CRT基因在人喉癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義，旨在為喉癌的基因治療提供有效的備選靶標(biāo)之一，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及主要試劑 從喉癌組織懸液提取的人喉癌上皮細(xì)胞；胎牛血清（NycoPrep公司）；HRP標(biāo)記的優(yōu)質(zhì)內(nèi)參（上海康成生物）；CRT抗體abcam；RIPA裂解液[碧云天（北京）]；Goat Anti-Rabbit IgG[Southern Biotechnology，Inc（USA）]；SDS-PAGE試劑[Abcam，Inc（UK）]；Peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG[博士德生物（武漢）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen）。

1.1.2主要儀器 流式細(xì)胞儀[BD Inc（USA）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix[Invitrogen Inc（USA）]；倒置熒光顯微鏡[Leica Inc（Germany）]；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱[Thermo Fisher Scientific Inc（USA）]。

1.2主要實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單細(xì)胞懸液制備 取少量喉癌組織約0.5 g置于勻漿器中，清洗后仔細(xì)剔除脂肪、壞死組織、纖維及結(jié)締組織；用干凈的組織剪將組織充分剪小、剪碎并不斷輕微揉搓，置120目不銹鋼網(wǎng)上，然后邊輕搓邊用純凈水不斷沖洗，靜置待自然沉淀后收集喉癌組織細(xì)胞混懸液；將混懸液用300目尼龍細(xì)網(wǎng)再次過(guò)濾，靜置后收集細(xì)胞懸液。將此懸液置于離心機(jī)1200 r/min，離心2～5 min，棄上清液后再次1200 r/min離心2 min，棄上清液后加入1 ml PBS將細(xì)胞懸浮，記數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。

1.2.2 RT-PCR 按照TRIzol的操作說(shuō)明對(duì)組織蛋白進(jìn)行RNA提取，用紫外分光光度儀進(jìn)行總RNA定量后，按逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄體系推薦的2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄，并用于做q-PCR。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，β-actin為內(nèi)參照；β-actin-F：5′-TGCATGAGGATGCAGCAGTT-3′，β-actin-R：5′-TCCGCGACAATGTGATCTTA-3′；擴(kuò)增片段大?。害?actin為235 bp；CRT-F：5′-CTAGATGAGTTGAAGCAGTG-3′，CRT-R：5′-CGGGATCTAATATGTGTCTC-3′；目的片段：CRT為225 bp。以（Oligo）dT作為引物據(jù)序列互補(bǔ)原則，利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA第一鏈后，取5 μl cRNA為模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR管中依次加入第一鏈cRNA、上游下游引物各5 μl、2xSYBR Green qPCR SuperMix 10 μl、Dntp5 10μl、Taq酶（2 U/10 μl）210 μl，適量ddH2O加至共體積20 μl，輕輕混合均勻離心，設(shè)定參數(shù)后在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，行瓊脂糖凝膠電泳后查看試驗(yàn)結(jié)果。設(shè)置以喉癌組織標(biāo)本細(xì)胞作為試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)HEP2-A組，與來(lái)自未經(jīng)任何處理的正常機(jī)體細(xì)胞作為試驗(yàn)的對(duì)照HEP2-B組。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 32 s讀板，40 cycles。

1.2.3 Western blotting 根據(jù)制備的細(xì)胞懸液喉癌細(xì)胞量加入相應(yīng)RIPA裂解液，勻漿置冰，裂解30 min后（過(guò)程中要經(jīng)常指彈便于充分裂解）常規(guī)提取細(xì)胞蛋白行蛋白的初步定量分析；取樣品50 μg，與上樣緩沖液按2∶1混合，沸水浴5 min充分混合均勻；配制4%的濃縮膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳（80 V恒壓50 min，或60 V轉(zhuǎn)移2 h，或40 V轉(zhuǎn)移3 h，轉(zhuǎn)完出現(xiàn)溴酚藍(lán)剛出膠底部止）、轉(zhuǎn)膜至常規(guī)PVDF膜，5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，一抗4℃過(guò)夜、二抗37℃孵育1 h，TBST液洗滌5 min×3次，加入Immobilon Western Chemilum HRP Substrate，雜交膜表面上反應(yīng)5 min，去盡殘夜，濾紙吸凈多余底物溶液，備好1×顯影液和定影液，于暗室中曝光、顯影、定影。同時(shí)設(shè)置以β-actin為內(nèi)參照，同樣以喉癌組織標(biāo)本細(xì)胞作為試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組，而來(lái)自未經(jīng)任何處理的正常機(jī)體細(xì)胞作為對(duì)照組；應(yīng)用凝膠圖像處理分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像掃描分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)或單向方差分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2結(jié)果

2.1 RT-PCR

試驗(yàn)樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)分析5、15、20 s rRNA 3條帶譜，其完整性系數(shù)提示純度檢測(cè)無(wú)蛋白污染；完整性檢測(cè)Total RNA抽提完整（圖1）。結(jié)果顯示，CRT mRNA于喉癌細(xì)胞mRNA表達(dá)有明顯升高，實(shí)驗(yàn)HEP2-A組的表達(dá)陽(yáng)性率升高67%，高于設(shè)置的對(duì)照HEP2-B組（t=3.20，P<0.05），CRT-mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.17，P<0.05）（表1）。

2.2 Western blotting

分別將對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組提取細(xì)胞蛋白并檢測(cè)細(xì)胞CRT蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組目的基因在喉癌細(xì)胞中有顯著的蛋白表達(dá)提升，經(jīng)過(guò)對(duì)其灰度分析后顯示目的蛋白在喉癌細(xì)胞中較對(duì)照組提升71%CRT的表達(dá)；而非靶向蛋白β-actin的表達(dá)無(wú)影響；分析CRT蛋白表達(dá)率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

3討論

CRT最初被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）上的鈣離子結(jié)合蛋白，其進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性，最初是從兔骨骼肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離提取而來(lái)；近年研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞外也有表達(dá)，其蛋白由單基因編碼，具有多種生物學(xué)功能，包括蛋白加工、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)、抑制瘤體血管增生和參與抗原遞呈及腫瘤瘤體細(xì)胞凋亡等各項(xiàng)功能。另外，CRT在腫瘤胞膜穩(wěn)定完整的表達(dá)可促進(jìn)某些腫瘤的免疫原性凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)刺激的感受性增強(qiáng)[3]。在腫瘤的實(shí)際治療過(guò)程中，免疫治療與化療往往很難很好地結(jié)合在一起，患者經(jīng)過(guò)幾個(gè)療程的化療之后，體內(nèi)大量的免疫效應(yīng)器被破壞，所以針對(duì)腫瘤的抗原免疫反應(yīng)在體內(nèi)很難產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)CRT過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療而誘發(fā)的胞體凋亡更顯敏感，在細(xì)胞表面被作為凋亡細(xì)胞的標(biāo)志，可以作為信號(hào)刺激因子被吞噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬，從而引起腫瘤細(xì)胞的免疫原性凋亡；還可通過(guò)阻止Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、改變Ca2+穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)P53功能，以調(diào)整其誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。此外，凋亡腫瘤細(xì)胞表面的CRT還可能被抗原呈遞細(xì)胞-樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別，從而促進(jìn)清除凋亡細(xì)胞，參與抗原提呈和活化特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)[5]。近年來(lái)的研究顯示，CRT從細(xì)胞的ER移位到胞膜是凋亡細(xì)胞免疫原性的重要標(biāo)志，這種生物學(xué)上的轉(zhuǎn)移決定特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，利于腫瘤的優(yōu)化性治療，提示CRT與E6或E7聯(lián)合的疫苗均使置瘤的荷瘤實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生了抗E6或E7的顯著T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答[6-8]。CRT的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)性免疫原性死亡，有利于清除殘瘤腫瘤細(xì)胞，這為以后的抗腫瘤治療提供了一種可能有效的免疫治療新靶點(diǎn)。在臨床腫瘤診斷方面，多種腫瘤細(xì)胞表面CRT及其裂解片段較正常組織有差異性表達(dá)量的改變，這為腫瘤的診斷提供了有利的幫助，這種發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)性[9-10]，提示其可能成為新腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值備選因子之一，以后有望在腫瘤的早期診斷及疾病預(yù)后判斷發(fā)揮作用。在膀胱癌的研究中，通過(guò)檢測(cè)尿中CRT發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯增加，考慮是否將CRT作為潛在生物學(xué)標(biāo)志應(yīng)用于早期診斷[9]。另外，在結(jié)腸癌、宮頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，尤其在高度惡性和低分化區(qū)域，CRT的高表達(dá)直接關(guān)系到腫瘤的進(jìn)展，提示CRT與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有直接的關(guān)系[10-11]。另用含有特異性CRT融合基因載體和含CRT的基因疫苗免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，結(jié)果觀察到荷瘤小鼠的抗瘤效應(yīng)非常明顯，并且多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)并強(qiáng)化了荷瘤小鼠的免疫記憶細(xì)胞，這為將來(lái)的腫瘤治療性疫苗的開(kāi)發(fā)研究邁出了不可或缺的關(guān)鍵一步[12-17]。

本研究中，為了進(jìn)一步明確CRT在喉鱗狀細(xì)胞癌中作用，筆者將喉癌組織通過(guò)熒光定量PCR、Western blot，檢測(cè)CRT在mRNA與蛋白水平上的差異性變化。結(jié)果顯示，喉癌組織CRT的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，初步提示CRT可能參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其表達(dá)上調(diào)在喉癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，CRT可能是喉鱗狀細(xì)胞癌一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)。但是，因腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的多因素復(fù)雜性，可能涉及相關(guān)多基因[18]，CRT單獨(dú)或聯(lián)合其他基因的綜合治療性實(shí)驗(yàn)研究還有待進(jìn)一步證實(shí)；CRT能否真正成為喉癌臨床治療的有效靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步的深入研究。

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（收稿日期：2018-09-04 本文編輯：祁海文）