李萍 宋娟 李清漪 張奇 崔紅霞 關(guān)寶生 趙玉杰 宋志斌

[摘要]目的 探討玉米須黃酮提取物對改良痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的療效。方法 選取56只Wistar大鼠，將其隨機(jī)分為空白對照組，模型組，秋水仙堿組，苯溴馬隆組，玉米須黃酮提取物高、中、低劑量組，每組8只，建立改良急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型并給予相應(yīng)藥物干預(yù)，于踝關(guān)節(jié)造模后12、24、36、48 h測量各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)周長并計(jì)算腫脹度；給藥7 d后檢測各組大鼠血清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和尿酸（UA）水平。結(jié)果 模型組在各時間節(jié)點(diǎn)的關(guān)節(jié)腫脹度均高于空白對照組（P<0.01）。與模型組比較，在踝關(guān)節(jié)造模24 h后，秋水仙堿組，黃酮提取物高、中劑量組的踝關(guān)節(jié)腫脹度均低于模型組（P<0.05）。給藥7 d后，模型組大鼠血清IL-1β和UA水平顯著高于空白對照組（P<0.01），黃酮提取物高、中劑量組及秋水仙堿組大鼠血清IL-1β表達(dá)水平均低于模型組（P<0.05）；黃酮提取物高、中劑量組及苯溴馬隆組大鼠血清UA水平均低于模型組（P<0.01）。結(jié)論 玉米須黃酮提取物可能通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性炎癥反應(yīng)，降低UA水平。

[關(guān)鍵詞]急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；黃酮；玉米須；白細(xì)胞介素-1β；尿酸

[中圖分類號] R965.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）12（a）-0008-04

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是一組由嘌呤代謝紊亂，尿酸產(chǎn)生增多和（或）尿酸排泄減少，導(dǎo)致單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體沉積在關(guān)節(jié)腔、滑膜囊、軟骨等軟組織引起的無菌性急性炎癥反應(yīng)，是痛風(fēng)典型的臨床表現(xiàn)[1-3]。其全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人類健康?，F(xiàn)臨床治療AGA多以西藥為主，起效雖快，但對胃腸功能、肝腎功能、骨髓造血功能等存在嚴(yán)重?fù)p害[4-6]。因此，越來越多的抗痛風(fēng)天然藥物研究引起人們關(guān)注，且其療效和副作用在一定程度上得到證實(shí)。

玉米須（Stigma Maydis）為禾本科植物玉米的雌花花柱，最早記載于《滇南本草》，是《中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)》1985版（一部）收錄的常用藥材品種，含有多聚戊糖、黃酮類、揮發(fā)油、皂普、生物堿等多種活性成分，有顯著的利尿、降血糖、抑菌、降壓、增強(qiáng)免疫、抗癌等功效[3]。其中黃酮類化合物有抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂等作用[4-5]。本研究在建立氧嗪酸鉀和MSU聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠改良GA模型的基礎(chǔ)上，探究玉米須黃酮提取物對改良AGA模型大鼠的影響及可能作用機(jī)制，為抗痛風(fēng)天然藥物的研發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

選取Wistar雄性大鼠，體重180～220 g，動物使用許可證號：SYXK（黑）2016-001。購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)條件：室溫20～25℃，濕度40%～50%，自然晝夜節(jié)律，定期更換墊料。

1.2試劑與儀器

玉米須黃酮提取物（黃酮類化合物含量20%，哈爾濱賽百奧科技有限公司）；氧嗪酸鉀（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；MSU晶體（美國Sigma公司）；秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司）；大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；尿酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）；酶標(biāo)儀（Lay systems Multiskan Ascent）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組及給藥 選取56只Wistar大鼠，隨機(jī)分為7組，分別為空白對照組，模型對照組，秋水仙堿組，苯溴馬隆組，玉米須黃酮提取物高、中、低劑量組。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，秋水仙堿組給予秋水仙堿0.9 mg/100 g，苯溴馬隆組給予苯溴馬隆1 mg/100 g，玉米須黃酮提取物高、中、低劑量組分別給予0.5、0.25、0.125 g/100 g，空白對照組和模型組給予等體積蒸餾水，每日上午9：00灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.3.2動物模型的建立 參照呂軍等[10]建立的高尿酸血癥并AGA大鼠模型進(jìn)行造模?？瞻讓φ战M：每日上午8：00和晚上20：00腹腔注射生理鹽水1 ml/100 g，2次/d，連續(xù)注射7 d，期間于第5天上午10：00，用6號注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°～40°方向進(jìn)針，將0.2 ml生理鹽水注入關(guān)節(jié)腔中。模型對照組、秋水仙堿組、苯溴馬隆組、玉米須黃酮提取物高、中、低劑量組：每日上午8：00和晚上20：00腹腔注射3%氧嗪酸鉀1 ml/100g，2次/d，連續(xù)注射7 d，期間于第5天上午10：00，用6號注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30°～40°方向進(jìn)針，將0.2 ml尿酸鈉（25 mg/ml）注入關(guān)節(jié)腔中。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中，觀察并記錄各組大鼠食量、飲水、大小便、體重、毛發(fā)、精神狀態(tài)等變化。

1.4.2踝關(guān)節(jié)腫脹度檢查 用記號筆標(biāo)記各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)受試部位，確定每次測量位置一致。采用縛線法測量各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)原始周長，在踝關(guān)節(jié)造模后12、24、36、48 h分別測定踝關(guān)節(jié)周長。計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度=（測定周長-原始周長）/原始周長×100%。

1.4.3血清尿酸和IL-1β檢測 第7天給藥后1 h各組大鼠內(nèi)眥采血（采血前禁水、禁食12 h），靜置，以3000 r/min離心10 min，分離血清于EP管，采用酶比色法檢測尿酸含量，采用ELISA法檢測IL-1β水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，體重穩(wěn)定，毛發(fā)光滑，反應(yīng)敏捷。模型組大鼠關(guān)節(jié)紅腫，體重呈下降趨勢，毛發(fā)呈灰色，行動遲緩，精神萎靡。玉米須黃酮提取物組和秋水仙堿組給藥后精神狀態(tài)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)腫脹度減退，其中秋水仙堿組尤其明顯。

2.2各組不同時間節(jié)點(diǎn)踝關(guān)節(jié)腫脹度的比較

模型組在各時間節(jié)點(diǎn)的踝關(guān)節(jié)腫脹度均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型制備成功；提取物高、中劑量48 h，中劑量組36 h的踝關(guān)口節(jié)腫脹度均高于空白對照組（P<0.05）；秋水仙堿組在各時間節(jié)點(diǎn)的踝關(guān)節(jié)腫脹度均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提取物高、中劑量組在24、36、48 h時的踝關(guān)節(jié)腫脹度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1），提示玉米須黃酮提取物可減輕AGA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度。

2.3各組大鼠血清尿酸水平的比較

模型組大鼠的血清尿酸水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明模型制備成功；與模型組比較，提取物高、中劑量組及苯溴馬隆組，血清尿酸水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

2.4各組大鼠血清IL-1β表達(dá)水平的比較

模型組大鼠的血清IL-1β表達(dá)水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示模型制備成功；與模型組比較，提取物高、中劑量組及秋水仙堿組大鼠血清IL-1β濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表3）。

3討論

AGA是由高尿酸血癥引起尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)周圍而引發(fā)的最常見的炎性關(guān)節(jié)。研究表明，痛風(fēng)與高尿酸血癥直接相關(guān)[11]，當(dāng)人體血尿酸濃度>6.8 mg/dl 時會引起尿酸鹽結(jié)晶，因此高尿酸血癥是AGA的重要生化基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的AGA模型制備多采用關(guān)節(jié)穿刺法注入尿酸鈉，打破了高尿酸血癥與AGA的內(nèi)在聯(lián)系，同時，有研究發(fā)現(xiàn)，除人類和猿類之外的哺乳動物體內(nèi)存在尿酸分解酶，可將尿酸分解成尿囊素等排出體外，且其活性與尿酸濃度成正相關(guān)[12-13]。同時，局部關(guān)節(jié)的紅、腫使血液流速加快，可增加尿酸鈉的溶解度，使其加速進(jìn)入血液并被其中的尿酸分解酶分解[14]。本實(shí)驗(yàn)采用改良方法誘導(dǎo)AGA模型，在尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥模型的基礎(chǔ)上采用關(guān)節(jié)穿刺法注入尿酸鈉制備AGA模型，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)造模后12 h關(guān)節(jié)腫脹，24 h腫脹達(dá)到高峰，血清炎癥因子IL-1β、尿酸水平明顯高于空白對照組，提示AGA模型制備成功。本模型可排除動物自身尿酸分解酶對尿酸的分解作用，符合人類的自然病程，更有利于客觀全面地評價(jià)藥物的療效。

AGA急性發(fā)作病理過程中大量炎癥因子的釋放造成關(guān)節(jié)及周圍組織病損。有研究發(fā)現(xiàn)，AGA及高尿酸血癥患者血清中可檢測到高濃度的IL-1β，在AGA急性發(fā)作期IL-1β的活性最高，可見IL-1β在AGA的病損過程中起重要作用，被認(rèn)為是經(jīng)典的AGA調(diào)節(jié)劑[15-16]。已有研究表明[17-19]，前炎癥因子IL-1β的表達(dá)、成熟與分泌為AGA發(fā)病的主要機(jī)制，前IL-1β產(chǎn)生后通過MSU晶體激活中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶3炎癥體，促進(jìn)IL-1β的成熟及分泌，最后釋放至胞外的IL-1β可激活I(lǐng)L-1信號通路和髓樣分化因子（MyD88）依賴的核因子-κB（NF-κB）通路，引起中性粒細(xì)胞募集及更多的炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)，從而引發(fā)關(guān)節(jié)紅腫和關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作。因此，通過阻斷IL-1β的產(chǎn)生可影響AGA的發(fā)生、發(fā)展。

控制體內(nèi)尿酸水平是治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的關(guān)鍵。目前對痛風(fēng)急性發(fā)作的治療多選擇秋水仙堿、NSAIDs、糖皮質(zhì)激素等藥物；降尿酸藥包括非布司他、別嘌呤醇、促尿酸排泄藥、尿酸酶制劑等[20]，而同時緩解AGA發(fā)作的炎癥反應(yīng)和降尿酸的藥物少有報(bào)道。

梁艷文等[21]的研究表明，玉米須黃酮醇提取物，中、高劑量組有抗炎活性，可改善二甲苯致小鼠耳廓的腫脹、蛋清致大鼠足跖的腫脹。律廣富等[22-23]的研究表明，玉米須總黃酮提取物可緩解家兔關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥癥狀，促進(jìn)痛風(fēng)性腎病大鼠腎臟排泄尿酸。林賀等[24]的研究表明，玉米須黃酮提取物可降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1α、IL-6、TNF-α及ICAM-1、MMP-1水平。

本實(shí)驗(yàn)通過氧嗪酸鉀和尿酸鈉干預(yù)，在排除動物自身尿酸分解酶對尿酸的分解的基礎(chǔ)上，建立穩(wěn)定并符合人類自然病程的AGA模型，研究結(jié)果顯示，玉米須黃酮提取物中、高劑量可緩解AGA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，顯著抑制大鼠血清中IL-1β的表達(dá)水平，同時降低血清尿酸水平。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示玉米須黃酮提取物可緩解AGA模型大鼠的急性炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制IL-1β的表達(dá)，從而抑制炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)有關(guān)；同時降低血清尿酸水平，標(biāo)本兼治。對于玉米須黃酮提取物通過何種信號通路影響IL-1β表達(dá)以及發(fā)揮降尿酸作用，仍有待進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2018-06-12 本文編輯：許俊琴）