李思漫 黃杰安 覃蒙斌 張金秀 廖 存

（1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西南寧530007；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021）

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，它在癌癥死亡疾病譜中占據(jù)重要位置，為人類癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1-2］。 2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國男性結(jié)直腸癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤第2位，女性居第4位；男性結(jié)直腸癌死亡率高居所有惡性腫瘤第3位，女性居第2位［3］。由于目前人們行癌癥早期篩查意識不足及結(jié)直腸癌早期缺乏明顯的臨床癥狀，許多患者首次就診即被診斷為進(jìn)展期結(jié)直腸癌［4］。此外，盡管腫瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即行手術(shù)切除治療及予以術(shù)后放化療治療，許多患者術(shù)后仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后往往不佳［5］。因此，探索結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找潛在的治療靶點(diǎn)對結(jié)直腸癌的診療和改善生存預(yù)后有重要意義。

細(xì)胞周期失調(diào)通常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6-7］。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白7（CDCA7，也稱為JPO1）最初在轉(zhuǎn)染了Myc基因的成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其是一種參與腫瘤轉(zhuǎn)化的Myc反應(yīng)基因［8］，位于人類染色體2q31，其所編碼的由371個(gè)氨基酸組成的核蛋白CDCA7在細(xì)胞周期中呈周期性表達(dá)，并在G1至S期表達(dá)最高［9］。據(jù)報(bào)道，CDCA7在人類多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，如淋巴瘤、卵巢癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌、急性髓性白血病和食管癌［10-16］，因此，可以推測CDCA7與腫瘤之間可能存在密切關(guān)系。本研究旨在分析CDCA7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平和初步探討其臨床意義，以期為尋找結(jié)直腸癌治療潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 以2012年10月至2013年11月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的105例結(jié)直腸癌患者為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷為結(jié)直腸腺癌，且為首次確診；（2）患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前已行放化療的患者；（2）同時(shí)合并有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史。研究對象中男性62例，女性43例；年齡26～82歲，平均年齡（56.53 ±12.86）歲；腫瘤大?。? cm者64例，腫瘤大小≥5 cm者41例；腫瘤浸潤黏膜層（T1）17例，肌層及肌層以下 （≥T2）88例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移15例。每位患者另取距離癌腫10 cm處的正常黏膜組織標(biāo)本各一份。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過。

1.2 主要試劑 CDCA7多克隆抗體 （Thermo公司，美國），免疫組化SP試劑盒（北京中杉金橋公司，中國），DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，檸檬酸抗原修復(fù)液和蘇木素購自索萊寶生物公司。

1.3 CDCA7表達(dá)的檢測及陽性判定標(biāo)準(zhǔn) 采用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中CDCA7的表達(dá)。組織標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林浸泡固定，經(jīng)浸蠟包埋后制成4μm厚連續(xù)切片。結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟、脫水，以 0.01 mol/L枸櫞酸高壓修復(fù)6 min，然后用3%H2O2室溫孵育15 min，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min，正常山羊血清室溫封閉15 min后，滴加一抗（CDCA7濃度為1:100），置于濕盒中4℃孵育過夜，24 h后在室溫中復(fù)溫1 h，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色5 min，然后行蘇木素染色，最后使用中性樹膠封片。陽性對照由北京博奧森生物技術(shù)有限公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照 （其余步驟同上）。用Olympus顯微鏡及顯微攝像儀對染色組織切片進(jìn)行觀察，以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的黃色或黃褐色顆粒為SP免疫組化染色陽性，綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行半定量分析。根據(jù)免疫陽性細(xì)胞染色程度進(jìn)行評分（A）：無染色為0分；胞膜、胞質(zhì)或胞核內(nèi)見淡黃色顆粒計(jì)1分；較多棕黃色顆粒計(jì)2分；大量棕黃色顆粒計(jì)3分。每片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算染色陽性細(xì)胞所占比例 （B）：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。 A與B相加為其最后得分，0分判為“-”，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”，以“-”和“+”定義為陰性表達(dá)、“++”和“+++”定義為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（）表示；計(jì)數(shù)資料以（n）表示，采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher確切概率法進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸黏膜組織的SP免疫組化染色結(jié)果及CDCA7蛋白陽性表達(dá)率的比較CDCA7蛋白在兩種組織中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均出現(xiàn)了明顯的黃褐色顆粒（即SP免疫組化染色陽性），見圖1。結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸黏膜組織的CDCA7陽性表達(dá)率分別為80.00%（84/105）、56.19%（59/105），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.699，P=0.000）。

2.2 CDCA7的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 CDCA7表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

3 討 論

結(jié)直腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤，是人類腫瘤相關(guān)致死的主要原因之一。分子生物學(xué)研究表明［17］，許多癌基因、抑癌基因通過直接或者間接的作用最終導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常，致使腫瘤細(xì)胞無限制地自主分裂和增殖，與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白出現(xiàn)代謝紊亂甚至直接參與了腫瘤細(xì)胞的分裂活動(dòng)。在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程中，常伴隨有原癌基因的激活以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量周期蛋白的調(diào)控失衡［18］，而細(xì)胞周期控制失調(diào)往往易導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。

圖1 CDCA7在結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)（×400，SP）

表1 CDCA7的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系（n）

Myc基因家族屬于核蛋白類調(diào)控基因，其基因產(chǎn)物Myc蛋白在多種人類腫瘤中高表達(dá)，Myc蛋白通過誘導(dǎo)有絲分裂影響細(xì)胞周期進(jìn)程從而影響了腫瘤細(xì)胞的增殖過程［19］。 CDCA7被證實(shí)為Myc依賴性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因，二者相互關(guān)聯(lián)，CDCA7轉(zhuǎn)錄調(diào)控的失調(diào)與Myc所介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生有關(guān)［20］，提示作為與Myc相關(guān)聯(lián)的CDCA7可能也參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。有研究顯示CDCA7是一種分子大小為47-kD的核蛋白［8］，但本研究免疫組化SP染色法結(jié)果顯示CDCA7在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸黏膜組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可見表達(dá)，可能是因?yàn)椴煌慕M織中CDCA7的激活狀態(tài)不同，使得CDCA7在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了核轉(zhuǎn)移和胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中CDCA7陽性表達(dá)率高于癌旁正常黏膜組織，與已有研究結(jié)果相符［10，13-16］，且其陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌的腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM分期、是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CDCA7可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，抑制CDCA7的表達(dá)或有望成為防治結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)，CDCA7的表達(dá)水平或可為疾病的診治與預(yù)后評估提供一定參考依據(jù)。但本研究僅局限于臨床標(biāo)本的表達(dá)檢測，CDCA7與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系以及具體作用機(jī)制尚未明了，需要今后對CDCA7進(jìn)行更全面更深入的研究。

綜上所述，CDCA7在人結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率高于正常結(jié)直腸黏膜組織，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，CDCA7可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程。