耿娜娜 吳明松， 鄭翔 楊蕾 王宏陽(yáng) 李學(xué)英

1貴州省普通高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心（貴州遵義 563000）；遵義醫(yī)學(xué)院2口腔學(xué)院（貴州遵義 563000）；遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)3遺傳學(xué)教研室（貴州遵義 563000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在我國(guó)的發(fā)病率和病死率均較高，每年新發(fā)病率約占全球的55%，且呈上升趨勢(shì)［1-2］。肝癌早期發(fā)現(xiàn)困難，多數(shù)病患就診時(shí)已喪失手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，此外還具有惡性化程度高、生長(zhǎng)增殖迅速、轉(zhuǎn)移范圍廣和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，因此其臨床療效不太理想。HCC治療以手術(shù)切除為首選，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，需借助輔助性手段，其中化療是中晚期肝癌最常用的手段之一［2-3］。順鉑（cis?dichlorodiamine platinum，CDDP）是一種療效很好、具有廣譜性抗癌的化療藥物，臨床上可用于治療肝癌。然而，CDDP的毒副作用也較大，且隨著肝癌對(duì)化療藥物的敏感性降低和耐藥性增加，使得肝癌的治療受到較大程度的限制，因此尋找一種既能增加CDDP的化療活性，同時(shí)又能降低其毒副作用的藥物，探索肝癌治療的新方法，具有十分重要的意義。單寧酸（tannic acid，TA）是一種天然多酚類物質(zhì)，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。筆者前期的研究表明，TA能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticu?lum stress，ERS）凋亡途徑增強(qiáng)CDDP抗肝癌細(xì)胞HepG2的作用，降低CDDP的用量，從而減輕CDDP的化療毒性，但二者協(xié)同的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。轉(zhuǎn)錄活化因子6（activating transcription factor 6，ATF6）通路是ERS的主要通路之一。在ERS下，ATF6轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，經(jīng)特定蛋白酶水解后被活化，活化的ATF6可促進(jìn)C/EBP同源蛋白（C/EBP?homologous protein，CHOP）等ERS相關(guān)分子的表達(dá)。因此，本研究探討了ATF6?CHOP通路在TA與CDDP協(xié)同抗肝癌中的作用，為肝癌的臨床治療方案提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 儀器與試劑 單寧酸（C76H52O46）由Sigma公司生產(chǎn)，順鉑注射液［Cl2（NH3）2Pt］由山東齊魯制藥公司生產(chǎn)，RPMI?1640培養(yǎng)基來(lái)源于Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，RNAi?soTMPlus購(gòu)自TaKaRa Biotechnology公司，dNTP Mix（10 mmol/L）購(gòu)自上海生工生物公司，M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Bio?Rad公司，PCR引物由上海生工生物公司合成，兔抗人多抗ATF6和ATF6B、兔抗人β?actin單抗和抗兔的二抗均購(gòu)自Protein?Tech Group公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司），CFX ConnectTMOptics Module PCR儀（Bio?Rad公司），IX73倒置熒光顯微鏡（Olympus公司），GOLD?SIM二氧化碳培養(yǎng)箱（西盟國(guó)際公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞系培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、2.0 g/L NaHCO3，置于37℃、95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用180 μmol/L TA、0.9 μg/mL CDDP單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞24和48 h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，按試劑盒方法合成cDNA。引物：β?actin，F(xiàn)：CGGGAAATCGTGCGT?GAC，R：CAGGAAGGAAGGCTGGAAG；ATF6（α），F(xiàn)：TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA，R：CTTGGGCTG AATTGAAGGTTTTG；CHOP，F(xiàn)：CAAGAGGTCCTG TCTTCAGATGA，R：TCTGTTTCCGTTTCCTGGTTC。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，Sso Fast Eva Green supermix 5 μL，3′引物和 5′引物各0.5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至 10 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，56 ℃（β?actin）、62.4 ℃（ATF6）或58℃（CHOP）30 s，40個(gè)循環(huán)周期。每個(gè)樣品設(shè)3管重復(fù)。以β?actin作為內(nèi)參，采用2?△△CT的方法，用3次重復(fù)的平均值計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 蛋白免疫印跡 藥物處理24和48 h后，裂解細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，以BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取一定體積量蛋白樣品，進(jìn)行變性、SDS?PAGE電泳、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉2 h、孵育一抗（ATF6 1∶3 000；ATF6B 1∶1 000；CHOP 1∶1 000；β?actin 1∶10 000）、洗滌后加二抗（1∶2 000）、加ECL發(fā)光試劑曝光與顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，IPP軟件分析蛋白免疫印跡條帶灰度值，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TA與CDDP聯(lián)合促進(jìn)HepG2細(xì)胞ATF6的表達(dá) 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，24和48 h時(shí)，TA組、CDDP組和聯(lián)合用藥組ATF6 mRNA水平（圖2A）和蛋白水平（圖1、圖2B）均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與24 h相比，48 h時(shí)TA組、CDDP組ATF6 mRNA和蛋白水平均呈升高趨勢(shì)，聯(lián)合用藥組ATF6 mRNA水平呈升高趨勢(shì)，蛋白水平呈降低趨勢(shì)。

圖1 Western Blot檢測(cè)ATF6、ATF6B和CHOP蛋白的表達(dá)Fig.1 Detection of ATF6、ATF6B and CHOP levels by Western Blot

2.2 TA與CDDP聯(lián)合促進(jìn)HepG2細(xì)胞ATF6B蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，24和48 h時(shí)，TA組、CDDP組和聯(lián)合用藥組ATF6B蛋白水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與24 h相比，48 h時(shí)TA組、CDDP組ATF6B蛋白水平呈升高趨勢(shì)，聯(lián)合用藥組呈降低趨勢(shì)（圖1、圖3）。

圖2 TA與CDDP對(duì)ATF6表達(dá)的影響Fig.2 Effects of TA and CDDP on ATF6 expression level

圖3 TA與CDDP對(duì)ATF6B蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of TA and CDDP on ATF6B expression level

圖4 TA與CDDP對(duì)CHOP表達(dá)的影響Fig.4 Effects of TA and CDDP on CHOP expression level

2.3 TA與CDDP聯(lián)合促進(jìn)HepG2細(xì)胞CHOP的表達(dá) 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，24和48 h時(shí)，TA組、CDDP組和聯(lián)合用藥組CHOP mRNA水平（圖4A）和蛋白水平（圖1、圖4B）均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與24 h相比，48 h時(shí)TA組、CDDP組CHOP mRNA和蛋白水平均呈升高趨勢(shì)，聯(lián)合用藥組CHOP mRNA和蛋白水平均呈降低趨勢(shì)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞中部分ERS是由不同的微環(huán)境改變所引發(fā)的，如缺氧、酸中毒等［4］。這種應(yīng)激環(huán)境能夠激活未蛋白折疊反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），UPR作為一種促進(jìn)癌細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激和生存的選擇性因素，從而增加癌細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的抵抗性［5-6］。ERS發(fā)生時(shí)，一方面細(xì)胞啟動(dòng)生存途徑，增加蛋白質(zhì)的正確折疊，降低和清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)；另一方面，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂持續(xù)進(jìn)行，ERS時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、強(qiáng)度過(guò)大時(shí)，最終會(huì)通過(guò)ERS凋亡通路啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［7-8］。因此，通過(guò)誘導(dǎo)ERS促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，有望成為腫瘤治療的新方法、新途徑［8］，而ATF6就是ERS的一個(gè)主要靶點(diǎn)［9］。

ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一種Ⅱ型跨膜蛋白，有ATF6α（ATF6）和 ATF6β（ATF6B）兩種亞型，其 N端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，具有鋅指結(jié)構(gòu)（b?ZIP），C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，可感受ERS。ERS發(fā)生時(shí)，ATF6與78kDa調(diào)節(jié)血糖蛋白（glucose regulated protein，GRP78）分離后被運(yùn)輸至高爾基體，高爾基體中的S1P（site 1 protease）和S2P（site 2 protease）蛋白酶相繼水解ATF6，釋放b?ZIP結(jié)構(gòu)域，激活ERS元件基因啟動(dòng)子區(qū)域，活化CHOP，誘導(dǎo)折疊酶和伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)促進(jìn)X盒結(jié)合蛋白1（X box?binding protein?1，XBP?1）轉(zhuǎn)錄的激活。激活后的CHOP和XBP1能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［10］。對(duì)HBV誘導(dǎo)的肝癌患者研究中發(fā)現(xiàn)，ATF6表達(dá)顯著升高，提示ATF6的高表達(dá)可能與肝癌的易感性有關(guān)［11］。另有研究表明，在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌病變小鼠及肝癌HepG2細(xì)胞中，褪黑素可激活A(yù)TF6通路，并促進(jìn)CHOP的表達(dá)，來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12-13］。CHOP能夠增強(qiáng)應(yīng)激細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，誘發(fā)氧化應(yīng)激和ATP耗竭，產(chǎn)生蛋白毒性［14-15］。非ERS下，CHOP的表達(dá)水平并不高；ERS下，CHOP轉(zhuǎn)錄水平大大提高，其高表達(dá)影響了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白折疊的修飾，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，CHOP被認(rèn)為是ERS凋亡通路激活的特異性分子之一［16］。

本研究顯示，在無(wú)ERS的對(duì)照組細(xì)胞中ATF6、ATF6B和CHOP的水平均較低，但在TA組、CDDP組、聯(lián)合用藥組中三者的表達(dá)均顯著上調(diào)，表明TA與CDDP的協(xié)同抗HepG2作用與ATF6?CHOP通路的激活密切相關(guān)。代榮陽(yáng)等［17］利用順鉑化療肝癌時(shí)，肝癌細(xì)胞中ATF6表達(dá)上調(diào)，激活了ERS通路，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，本研究結(jié)果與其具有一致性。TA與CDDP協(xié)同抗HepG2的主要機(jī)制可能是當(dāng)細(xì)胞受到ERS刺激之后，ATF6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，其下游的ATF6和ATF6B可與CHOP啟動(dòng)子上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERS re?sponse element，ERSE）結(jié)合，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，高表達(dá)的CHOP能抑制抑凋亡蛋白Bcl?2的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax由細(xì)胞質(zhì)向線粒體移位，從而觸發(fā)細(xì)胞的Bax/Bad系統(tǒng)，激活Caspase?9和Caspase?3分子，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［18］。盡管本研究中TA與CDDP聯(lián)合用藥24和48 h后，ATF6?CHOP通路的激活水平基本是一致的，但在48 h時(shí)ATF6、ATF6B和CHOP的表達(dá)水平整體呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，可能是由于細(xì)胞早期時(shí)活力高，應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能力較好；但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的藥物干預(yù)后，細(xì)胞凋亡水平持續(xù)上調(diào)，細(xì)胞活力和應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能力反而有所下降，ATF6、ATF6B和CHOP的表達(dá)隨之降低，還需進(jìn)一步研究其具體機(jī)制。最新研究表明，衣霉素能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中CHOP的表達(dá)，特異性敲除CHOP基因后，衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬增強(qiáng)，同時(shí)ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被抑制［19］，提示本研究中TA聯(lián)合CDDP促進(jìn)HepG2細(xì)胞中CHOP的高表達(dá)，不僅與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)，可能還與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究表明TA聯(lián)合CDDP增強(qiáng)了肝癌HepG2細(xì)胞中ATF6、ATF6B和CHOP分子的激活水平。本研究首次證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6?CHOP通路與TA協(xié)同增強(qiáng)CDDP抗肝癌的作用密切相關(guān)，為臨床上肝癌的治療方案提供了新思路，但還需要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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