崔春便 賈新未 王艷飛 李雅 王占啟 王敬

河北大學附屬醫(yī)院（河北保定 071000）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）發(fā)生后，心肌每天從循環(huán)系統(tǒng)招募數(shù)十萬白細胞，骨髓造血系統(tǒng)也迅速啟動造血生成［1］，同時交感神經(jīng)也會刺激造血祖細胞遷移至脾臟，產(chǎn)生骨髓外造血［2］，分化出大量白細胞，進一步促進炎癥的產(chǎn)生，加重心機重構(gòu)，造成巨大危害。因此，研究MI發(fā)生后對白細胞生成的影響，對抑制MI后炎癥加重有重要的臨床意義。

白細胞介素 6（interleukin 6，IL?6）是多源高效的細胞因子，其與細胞膜上的IL?6受體（IL?6R）結(jié)合后激活并促進炎癥的發(fā)生［3］。研究表明IL?6可促進造血干細胞的產(chǎn)生，并在血液細胞分化中起重要作用［4-5］。同時，研究表明MI發(fā)生后會釋放大量可溶性細胞因子，如C3、C4、IL?1、IL?4、IL?6 等［6］，但 MI發(fā)生后 IL?6 是否可以直接促進白細胞產(chǎn)生目前并無相關(guān)報道。本研究旨在探討MI發(fā)生后，IL?6與白細胞產(chǎn)生的關(guān)系，靶向抑制IL?6R對機體白細胞產(chǎn)生的影響，為尋找臨床治療MI后改善心肌重構(gòu)的新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 IL?6受體抑制劑Tocilizumab托珠單抗注射液購自Roche/Genentech公司，威斯塔大鼠（8～12周齡）購自北京維通利華實驗動物有限公司，膠原酶購自SIGMA公司，鼠B220、CD11b、Ly6G、CD31、鼠平滑肌肌動蛋白（α?smooth muscle actin，αSMA）、膠原蛋白1（collagen?1）抗體購自eBiosci?ence公司，IL?6 ELISA檢測試劑盒購自R&D Sys?tems公司，F(xiàn)ITC/APC溴脫氧尿苷（Bromodeoxyuri?dine，BrdU）細胞增殖檢測試劑盒、重組鼠源IL?6（Recombinant mouse IL?6，RmIL?6）購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 心梗動物模型的構(gòu)建 大鼠氣管插管，吸入麻醉后消毒，沿左側(cè)第4脅間做橫向小切口，擠壓胸腔，使心臟擠出并堵塞切口，或用7-0號細線結(jié)扎將心臟冠狀動脈左前降支結(jié)扎，將心臟復位并縫合胸腔，抽出胸腔殘余氣體，制做MI模型［7］。

1.2.2 不同部位IL?6的濃度 大鼠心臟取血，室溫下凝固20 min，2 000 G離心后，吸取血清待測。將鼠處死，取心臟，顯微鏡下將梗死和非梗死部分分離，冰上將組織機械勻漿并加入RIPAA buffer消化30 min，12 000 G離心15 min，吸取上清待測。骨髓待測樣處理同心臟。將不同組織的待測樣用IL?6檢測試劑盒檢測。

1.2.3 骨髓造血干細胞增殖情況檢測 取未經(jīng)處理、注射RmIL?6及行心梗模型手術(shù)后Tocilizumab治療及未經(jīng)治療的大鼠的骼組織，膠原酶消化后，經(jīng)細胞篩過濾后獲取骨髓細胞，流式細胞儀分選出骨骼造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）。將HSC細胞與FITC/APC溴脫氧尿（BrdU）共同孵育染色后，流式細胞術(shù)分析。

1.2.4 白細胞檢測 MI 48 h后，取對照小鼠、Tocilizumab處理與未處理的MI大鼠血液，血常規(guī)細胞計數(shù)。

1.2.5 靶向抑制IL?6R 心梗手術(shù)后2 h開始治療，通過皮下注射IL?6R抑制劑Tocilizumab，每天2次。

1.2.6 心肌組織炎癥檢測 取未經(jīng)任何處理、MI術(shù)后未處理及術(shù)后Tocilizumab治療7 d的大鼠MI區(qū)組織，免疫組化檢測髓系細胞（CD11b）及中性粒細胞（Ly6G）的情況，顯微鏡觀察。

1.2.7 心肌纖維化檢測 取未經(jīng)任何處理、MI術(shù)后未處理及術(shù)后Tocilizumab治療7 d的大鼠MI區(qū)組織，利用免疫組化技術(shù)標記MI區(qū)平滑肌肌動蛋白（αSMA）、心肌膠原沉著情況（collagen?1）及新生血管情況（CD31）。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差，調(diào)查組間比較采用方差分析，增殖期HSC比率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心梗手術(shù)后促進不同組織IL?6的表達 見圖1，筆者發(fā)現(xiàn)在大鼠MI發(fā)生后，在心肌組織、血清及骨髓組織的IL?6水平顯著高于未有MI的大鼠組（對照組）。在心肌和血清組織中，IL?6在心梗出現(xiàn)后24 h后升高最為明顯（P＜0.05），MI發(fā)生72 h后IL?6水平有所降低，并顯著低于24 h水平（P＜0.05）。情況不同的是，在MI發(fā)生72 h后，骨髓組織中有較對照組明顯增高的IL?6表達（P＜ 0.05）。

圖1 IL?6在大鼠心梗后不同時間內(nèi)不同組織中的水平Fig.1 The expression level of different tissues in different times

2.2 IL?6促進骨髓造血干細胞增殖 見圖2，為了驗證心梗發(fā)生后釋放的IL?6能否刺激造血干細胞的產(chǎn)生，分離大鼠骨髓HSC并用只能標記增殖期的BrdU染色進行流式分析。結(jié)果表明，在心梗發(fā)生48 h后，骨髓增殖期（S+G2/M期）HSC的比例顯著高于對照組（P＜0.05）。用RmIL?6處理的大鼠，骨髓增殖期（S+G2/M期）HSC的比例較對照組升高的更為明顯（P＜0.05）。

2.3 IL?6促進白細胞的產(chǎn)生 MI模型術(shù)后48 h抽取對照組、MI組及RmIL?6組大鼠血液進行血常規(guī)WBC計數(shù)檢測。注射了RmIL?6及MI 48 h模型大鼠血WBC計數(shù)明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 靶向抑制IL?6R抑制心梗后HSC的增殖 見圖4，利用IL?6R靶向抑制劑Tocilizumab治療MI 48 h后的大鼠，其骨髓處于增殖期HSC的比例明顯被抑制（P＜0.05），接近至對照組水平（P＞0.05）。說明Tocilizumab可以抑制骨髓HSC的增殖。

2.5 靶向抑制IL?6R抑制白細胞的產(chǎn)生 為了驗證IL?6促進WBC產(chǎn)生的效果是否會被IL?6R特異性靶向抑制劑Tocilizumab所抑制，筆者進而又抽取MI 48 h大鼠模型、MI用Tocilizumab處理后及對照大鼠的血液，行血常規(guī)WBC計數(shù)。經(jīng)Tocilizum?ab處理后的MI大鼠，其WBC的產(chǎn)生明顯被抑制（P＜0.05）。見圖5。

2.6 靶向抑制IL?6R抑制心肌組織炎癥的產(chǎn)生 在大鼠MI后7 d將大鼠處死，取出心臟組織，對梗死區(qū)行免疫組化分析，檢測心肌組織內(nèi)的骨髓來源細胞（CD11b）及中性粒細胞（Ly6G）的分布情況。見圖6，對照組CD11b及Ly6G陽性細胞數(shù)目明顯多于Tocilizumab治療組。說明Tocilizumab可以抑制心梗區(qū)炎性細胞浸潤。

圖2 不同情況下骨髓中S+G2/M期造血干細胞所占的比例Fig.2 The proportion of S+G2/M HSC of marrow in different conditions

圖3 大鼠血常規(guī)白細胞計數(shù)Fig.3 The number of WBC of rat

圖4 不同情況下骨髓中S+G2/M期造血干細胞所占的比例Fig.4 The proportion of S+G2/M HSC of marrow in different conditions

圖5 大鼠血常規(guī)白細胞計數(shù)Fig.5 The number of WBC of rat

2.7 靶向抑制IL?6R抑制心肌纖維化 在大鼠MI后7 d處死大鼠并取出心臟，利用免疫組化技術(shù)標記MI區(qū)平滑肌肌動蛋白（αSMA）、心肌膠原沉著情況（collagen?1）及新生血管情況（CD31）。Tocilizum?ab治療后，心肌成纖維細胞標記物αSMA及colla?gen?1明顯減少，但新生毛細血管內(nèi)皮細胞（CD31）并沒有太大改變。見圖7。

3 討論

MI及動脈粥樣硬化在臨床上會引起包括骨髓激活在內(nèi)的復雜的嚴重并發(fā)癥［8］。正常情況下，盡管骨髓每天都會產(chǎn)生數(shù)以億計的血細胞，但骨髓增生的HSC通常只有很少一部分會進入血液循，且受到嚴格的調(diào)控。如果骨髓HSC增殖過于活躍，那么骨髓中的造血微環(huán)境便會產(chǎn)生一系列信號如CXCL12等使HSC靜止。當機體受到感染時，大量信號分子如干擾素、Toll樣受體等會釋放進血，促進白細胞的產(chǎn)生，有利于機體對病原體的防御。同時，MI患者的血液樣本中可檢測到大量的巨噬細胞［9］，且研究證實心血管患者的病死率與血液中的白細胞水平存在相關(guān)性［10-11］。但MI后白細胞的產(chǎn)生是否和內(nèi)源性炎性因子直接有關(guān)，目前尚不清楚。

圖6 大鼠MI 7 d后梗死區(qū)心肌組織炎性細胞的免疫組化圖Fig.6 The immunohistochemistry staining of inflammatory cells in MI area after MI 7 days

圖7 平滑肌肌動蛋白（αSMA）、心肌膠原沉著情況（collagen?1）及新生血管情況（CD31）的免疫組化圖Fig.7 The immunohistochemistry staining of αSMA，collagen?1 and CD31

人類患者MI及缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌分泌大量IL?6，其血清水平顯著升高［12-13］。因此，筆者首先制做了大鼠MI模型，并利用ELISA技術(shù)檢測到大鼠不同組織中的IL?6水平，證明MI發(fā)生后不同組織IL?6均會不同程度增高。盡管IL?6存在促炎和抗炎的雙重復雜作用［14］，但在MI中的研究表明，MI發(fā)生后細胞因子，如IL?6等的大量釋放是許多功能蛋白表達和活化的誘導因素［15］，在造血及HSC分化中起重要作用［4-5］。將RmIL?6注射給大鼠后同樣發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓中處于增殖期的HSC比率大大增加，進一步用血常規(guī)計數(shù)表明大鼠MI后血液中的白細胞數(shù)量明顯增加。這證明了MI后心肌分泌的IL?6可直接作用于骨髓造血系統(tǒng)，增加血液白細胞的數(shù)量。MI發(fā)生后心肌組織會有大量炎性細胞浸潤，這些炎性細胞會通過吞噬細胞碎片、激活基質(zhì)金屬蛋白酶（atrix metalloprotein?ase，MMP）重構(gòu)心肌細胞外基質(zhì)（xtracellular ma?trix，ECM），并分泌生長因子，促進顆粒狀血管生成和ECM蛋白沉積，對心肌有極大的毒性作用［16-17］。因此，如何防止梗死區(qū)擴大、改善心肌重構(gòu)是當代心血管醫(yī)生治療MI的重要任務(wù)，控制炎性細胞在心肌組織的浸潤是一個重要的選項。

有研究表明，采用特異性抗體靶向WBC，抑制它的激活、黏附及溢出等在改善MI大鼠心肌重構(gòu)方面起著重要作用［18-19］。但針對WBC的這些作用可能導致體內(nèi)WBC功能異常，造成免疫系統(tǒng)破壞。Tocilizumab是FDA于2010年批準，目前在我國上市的唯一一種針對IL?6R的特異性靶向抑制劑，已用于風濕性關(guān)節(jié)炎的治療。本研究在MI大鼠給予皮下注射Tocilizumab后，大鼠骨髓HSC增殖明顯被抑制，血液中的WBC數(shù)量明顯降低。在MI大鼠心肌組織中，炎性細胞浸潤明顯減少、心肌纖維化程度較對照組明顯改善，這說明Tocili?zumab對于改善大鼠MI后心肌重構(gòu)有著積極作用。

本研究表明，MI發(fā)生后心肌細胞分泌大量的IL?6，當它進入血液后可以直接作用于骨髓造血系統(tǒng)，刺激HSC的產(chǎn)生并向WBC分化，加重心肌的重構(gòu)。用IL?6R靶向抑制劑Tocilizumab治療后，IL?6與受體結(jié)合被阻斷，骨髓HSC比率降至正常水平，血WBC數(shù)量減少，心肌重構(gòu)得以改善。Tocilizumab可以抑制心梗后白細胞的產(chǎn)生并抑制心肌重構(gòu)。

本研究首次證明了MI發(fā)生后IL?6可直接刺激HSC增殖并向WBC分化，從而加重心肌重構(gòu)。進而用IL?6R抑制劑阻斷Tocilizumab IL?6R取得了良好的效果。但本研究未采用IL?6R基因缺失小鼠進行驗證，有待后續(xù)進一步驗證。

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