陳凱 劉濤 李張維 李梁 潘宣

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科（廣州 510080）

舌癌是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其多數(shù)為鱗癌。近年來(lái)，舌鱗癌的發(fā)病率有不斷升高的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化［1-2］。舌鱗癌的一般惡性程度高，生長(zhǎng)快，浸潤(rùn)性強(qiáng)；舌體本身活動(dòng)頻繁，具有豐富的淋巴管供應(yīng)和血液循環(huán)，常發(fā)生較高的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這些因素均直接影響舌癌患者的預(yù)后及生存。因此，關(guān)于舌鱗癌的形成、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制成為了當(dāng)下的研究重點(diǎn)。

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是整合素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，與細(xì)胞的黏附功能關(guān)系密切。近年來(lái)的相關(guān)研究表明，F(xiàn)AK可通過(guò)多條信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、侵襲及凋亡等生物學(xué)過(guò)程。然而，目前有關(guān)FAK基因與舌鱗癌的相關(guān)性的研究較少，其確切分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)采用RNA干擾（RNA interfer?ence，RNAi）技術(shù)對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞株 CAL?27進(jìn)行FAK基因沉默，探討FAK基因干擾對(duì)舌鱗癌細(xì)胞株CAL?27增殖及遷移能力的影響，以期為進(jìn)一步深入研究FAK基因在舌鱗癌細(xì)胞中異常表達(dá)的分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 舌鱗癌細(xì)胞株CAL?27由李勁松教授（中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科）惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清FBS購(gòu)自杭州四季青公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)TIANGEN公司；GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人FAK單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 FAK siRNA基因序列及其引物的設(shè)計(jì)和合成 在本課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中，針對(duì)FAK設(shè)計(jì)三條siRNA，經(jīng)過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用熒光定量PCR方法篩選出其中具有最佳抑制效果的FAK siR?NA，由廣州賽哲生物科技股份有限公司合成。選用的特異性FAK siRNA基因序列為：正義鏈：CAG?GUGAAGAGCGAUUAUATT；反義鏈：UAUAAUCG?CUCUUCACCUGTT。FAK siRNA序列引物由廣州賽哲生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)合成，上游：5′?TGTGGGTAAACCAGATCCTGC?3′；下游：5′?CT?GAAGCTTGACACCCTCGT?3′。同時(shí)設(shè)計(jì)了 GAP?DH 作為內(nèi)參物，上游：5′?TCATGAAGTGTGACGT?GGACATC ?3′；下 游 ：5′?CAGGAGGAGCAAT?GATCTTGATCT?3′。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用0.25%胰蛋白酶消化CAL?27細(xì)胞，以含10%血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后，按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種到六孔板中，置于置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，16～24 h后待細(xì)胞密度生長(zhǎng)到60%～70%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。

1.2.3 分組和轉(zhuǎn)染 本試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組使用FAK siRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；空白對(duì)照組未轉(zhuǎn)染任何RNA；陰性對(duì)照組使用無(wú)關(guān)序列RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備好細(xì)胞后，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 qPCR檢測(cè)FAK mRNA的表達(dá) （1）RNA的提取：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞，按照Trizol試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，通過(guò)細(xì)胞處理，分相及RNA沉淀、清洗、溶解5個(gè)步驟提取總RNA，檢測(cè)總RNA的濃度和純度。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，總RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。（3）進(jìn)行qPCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min后，再95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，總共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，結(jié)果在PCR儀器中自動(dòng)讀取和生成，儀器配套攜帶的軟件系統(tǒng)直接對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)FAK蛋白的表達(dá)（1）總蛋白提取：在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解，離心，收集上清。（2）測(cè)定蛋白濃度：制備1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液及考馬斯亮藍(lán)G?250反應(yīng)液，595 nm測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算樣品的蛋白濃度。（3）上樣：根據(jù)Wes 12～ 230 kDa Rabbit Master kit試劑盒和Wes 12～230 kDa Master kit with split Buffer試劑盒說(shuō)明書(shū)，完成加樣。將樣品放入Proteinsimple Wes儀器。其中，F(xiàn)AK一抗及內(nèi)參GAPDH一抗均為1∶50稀釋，二抗為試劑盒自帶。設(shè)置相關(guān)運(yùn)行參數(shù)，運(yùn)行后得出結(jié)果。

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變 將細(xì)胞按接種于孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔天待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組；分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h加入含量為5 mg/mL的MTT溶液，37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；吸盡各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO，水平震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處吸光值。

1.2.7 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞消化成單個(gè)懸液，配制濃度為4×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；預(yù)先將transwell小室置于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中平衡1 h；上室中加入細(xì)胞懸液，下室加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h；0.1%結(jié)晶紫常溫固定染色30 min，用棉棒輕輕擦去上室上表面的細(xì)胞；顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)CAL?27細(xì)胞FAK mRNA表達(dá)的影響 3組中FAK mRNA相對(duì)含量如圖1所示。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量分別為上述2個(gè)對(duì)照組的23.32%和21.25%，干擾效率為76.68%和78.75%。實(shí)驗(yàn)組中FAK mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 060.91，P＜ 0.01）。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)CAL?27細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)的影響 三組中FAK蛋白的表達(dá)量如圖2和圖3所示。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量分別為上述2個(gè)對(duì)照組的40.46%和49.59%。實(shí)驗(yàn)組中FAK蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.07，P＜0.05）。

圖1 各組細(xì)胞FAK mRNA表達(dá)變化Fig.1 The expression of FAK mRNA in each group

圖2 各組細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)變化Fig.2 The expression of FAK protein in each group

圖3 各組細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)水平Fig.3 The level of FAK protein expression in each group

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)CAL?27細(xì)胞增殖能力的影響 MTT增殖曲線反映了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況（圖4）。在48和72 h，兩個(gè)對(duì)照組的吸光度值均明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F48h=558.32，P48h＜ 0.01；F72h=120.52，P72h＜ 0.01）。而在24 h三組間差異無(wú)顯著性（F24h=1.32，P24h＞0.05）。沉默F(xiàn)AK基因，舌鱗癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。

圖4 各組細(xì)胞增殖能力的變化Fig.4 The proliferation ability of cells in each group

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)CAL?27細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，在空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)視野中穿過(guò)聚碳酸酯膜遷移至下室的細(xì)胞數(shù)分別為47.27±5.10，49.80±6.80及34.13±3.30（圖5）。實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯少于兩個(gè)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.6414，P＜0.05）。沉默F(xiàn)AK基因，舌鱗癌細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制。

3 討論

FAK也被稱為PTKⅡ，是整合素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，與細(xì)胞的黏附功能關(guān)系密切。FAK結(jié)構(gòu)較為特殊，其本質(zhì)上是一種非受體酪氨酸激酶，缺乏跨膜區(qū)，是純粹的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，但又不含有胞質(zhì)酪氨酸激酶常有的SH2和SH3結(jié)構(gòu)域［3］。FAK能夠催化多種底物蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中具有重要作用。在生理狀態(tài)下，F(xiàn)AK廣泛分布于人體的表皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中；但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，在病理狀態(tài)下，F(xiàn)AK的高表達(dá)與多種不同組織起源腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)［4-6］。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)FAK和p53的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)FAK可能參與調(diào)控了p53表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而遏制了腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程［7］。對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制FAK Tyr397和AKT Ser473位點(diǎn)的磷酸化，可以在極大程度上降低舌鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，進(jìn)而有效地抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［8］。

本研究運(yùn)用RNAi介導(dǎo)FAK基因沉默，分析對(duì)舌鱗癌CAL?27細(xì)胞增殖與侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染siRNA的CAL?27細(xì)胞中，F(xiàn)AK的mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯下降，這表明FAK在mRNA水平表達(dá)和蛋白水平表達(dá)上具有一致性，siRNA轉(zhuǎn)染能有效抑制FAK mRNA和FAK蛋白的表達(dá)水平。

同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染的CAL?27細(xì)胞增殖能力和遷移能力均受到了明顯抑制，這與上述文獻(xiàn)［7-8］的報(bào)道基本一致。FAK是多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，F(xiàn)AK通過(guò)激活PI3K?AKT等信號(hào)通路增加細(xì)胞DNA合成和加快G/S期的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞的增殖［9-11］；還可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CyclinD 1的表達(dá)［12］。細(xì)胞遷移過(guò)程包括細(xì)胞前沿偽足的形成，新黏附的建立、細(xì)胞體的收縮和尾部的分離。在遷移過(guò)程中，F(xiàn)AK可以作為一種接近整合素和生長(zhǎng)因子受體的蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用；FAK還能通過(guò)各種信號(hào)通路激活Rac、ERK或Rho，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組裝和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞遷移的調(diào)控［13-16］。FAK沉默后，可能影響了這些信號(hào)通路的激活及調(diào)控蛋白功能的發(fā)揮，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞增殖能力和遷移能力的下降。

綜合上述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAi技術(shù)沉默F(xiàn)AK，發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)的下調(diào)可以抑制舌鱗癌細(xì)胞CAL?27的增殖和遷移能力；提示FAK有望成為抑制舌鱗癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。但目前關(guān)于FAK在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的具體功能、所處地位的研究正處于起步階段，其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的具體機(jī)制仍未完全闡明，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

圖5 沉默F(xiàn)AK基因?qū)AL?27細(xì)胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of silencing FAK gene on migration of CAL?27 cells

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