謝智彬 付偉金 陸春宇 趙東 徐艷圳 吳華裕

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（南寧 530021）；廣西醫(yī)科大學（南寧 530021）

膀胱癌是泌尿系腫瘤中常見的惡性腫瘤［1］，具有易復發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移等特點，因此大部分患者確診時已達中晚期，所以抑制腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移對患者的生存預后及生存質(zhì)量有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）是指細胞失去上皮細胞特性和極性，重構細胞骨架網(wǎng)，使其獲得間皮細胞特性和運動能力，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［2］。因此，抑制EMT是當前抗膀胱癌的侵襲遷移研究的熱點。二氯乙酸（dichloroacetate，DCA），也稱二氯醋酸，是一種小分子代謝調(diào)節(jié)劑，臨床上主要用于治療乳酸中毒和線粒體遺傳性疾?。?］。近年來研究發(fā)現(xiàn)DCA在多種腫瘤細胞中具有明顯抗腫瘤活性，如腎癌、結(jié)腸癌、子宮癌等［4-6］，但DCA作用于膀胱癌T24細胞的克隆形成、侵襲及遷移的影響在國內(nèi)外卻鮮有報道。因此，2016年4-12月筆者觀察了DCA對膀胱癌T24細胞克隆形成、侵襲、遷移能力及對EMT相關蛋白表達的影響，并初步探討其相關機制，為逆轉(zhuǎn)膀胱癌轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細胞：人T24細胞株購自中國科學院細胞庫。藥物：二氯乙酸（Sigma）試劑：胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（gibco）、雙抗（gibco）、胰酶（gibco）、1640培養(yǎng)基（gibco）、Giemsa染液（Sigma）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）、PBS（Sig?ma）、Matrigel基質(zhì)膠（Corning）、RIPA細胞裂解液（Sigma）、BCA試劑盒（碧云天）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）、GAPDH引物、鈣黏蛋白E（E?cadherin）引物、鈣黏蛋白 N（N?cadherin）引物、波形蛋白（vimentin）引物Snail引物及Slug引物均由金開瑞生物工程有限公司合成。兔抗人β?肌動蛋白（β?actin）/E?cadherin/N?cadherin/vimentin/Snail/Slug 抗體（Abcam）。儀器：Transwell小室（Sigma）、各種規(guī)格培養(yǎng)瓶（皿）、離心管（Corning）、CKX41倒置顯微鏡（Olympus），37℃ 5%CO2恒溫孵育箱（Thermo）。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞用含有10%FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)基于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取生長對數(shù)期細胞用于實驗。

1.3 細胞克隆檢測 取對數(shù)生長期的T24細胞以500個/孔均勻接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，實驗組加入含5、10、20 mmol/L DCA的無血清培養(yǎng)基2 mL，對照組加入等量含0.1%DMSO的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，當肉眼可見克隆形成時，終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，用甲醇進行固定20 min，Giemsa染液染色30 min，沖洗后空氣干燥；拍照、計數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)目。實驗重復3次。

1.4 細胞劃痕檢測細胞遷移能力 將T24細胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細胞生長面積達90%后，用10 μL加樣槍頭對細胞進行劃痕損傷，每孔劃痕1次。用PBS洗3次，將脫落細胞和細胞碎片沖洗干凈。實驗分組及處理同1.3繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24、48、72 h倒置相差顯微鏡下觀察拍照（×100），根據(jù)細胞間距計算遷移率，細胞遷移率=（1-愈合后間距/起始間距）×100%。實驗重復3次。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 將T24細胞以1× 105/mL密度，200 μL接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，實驗分組及處理同1.3，下室加入600 μL含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細胞，甲醇固定10 min，0.1%的Giemsa染液室溫下染色30 min，鏡下隨機5個視野（×100）觀察結(jié)果并拍照、計數(shù)，取均值。實驗重復3次。

1.6 Real time PCR 法檢測 E?cadherin、N?cad?herin、vimentin、Snail及Slug mRNA的表達 取T24細胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時，實驗分組及處理同1.3繼續(xù)培養(yǎng)48 h，TRIzol法提取各組細胞的總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度；取1 μg總RNA，應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件37℃15 min、85 ℃ 5 s，以cDNA為模板應用Real time PCR檢測各組細胞中E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及Slug mRNA的表達。N?cadherin基因上游引物序列為 5′?GCCACCTACAAAGGCAGAAG?3′，下游引物序列為 5′?ACTGTCCCATTCCAAACCTG?3′；E?cadherin基因上游引物序列為5′?TCATGAGT?GTCCCCCGGTAT?3′，下游引物序列為 5′?TCTT?GAAGCGATTGCCCCAT?3′；vimentin基因上游引物序列為 5′?GGACCAGCTAACCAACGACA?3′，下游引物序列為 5′?AAGGTCAAGACGTGCCAGAG?3′；Snail基因上游引物序列為 5′?CTGGGTGCCCTCAA?GATGCA?3′，下游引物序列為 5′?CCGGACATG?GCCTTGTAGCA?3′；Slug基因上游引物序列為5′?ATCTGACCCGTCGTGACG?3′，下游引物序列為 5′?CGTCACGACGGGTCAGAT?3′；GAPDH 基因（內(nèi)參照）上游引物序列為 5′?CTATAAATTGAGCCCG?CAGC?3′，下游引物序列為 5′?GACCAAATCCGTT?GACTCCG ?3′；Real time PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95℃變性10 s、60℃退火10 s、72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。以2?ΔΔCt值表示目的基因 mRNA的相對表達水平。

1.7 Western blot檢測 E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及Slug蛋白的表達 將T24細胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時，實驗分組及處理同1.3繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS潤洗2遍后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4℃裂解30 min，12 000 r/min離心后取上清液。再按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度后加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min使蛋白變性后分裝，-20℃保存。取60 μg總蛋白上樣量，計算蛋白的上樣體積，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適比例的SDS?PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST潤洗后分別加入兔抗人β?actin、E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及 Slug抗體4℃孵育過夜，抗體稀釋度均為1∶1 000。TBST潤洗10 min×3次，常溫搖床下孵育熒光二抗（1∶5 000）1 h；用TBST溶液洗膜10 min×3次，熒光化學發(fā)光檢測儀檢測，圖像掃描。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與β?actin條帶的光密度比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，計量資料多組間均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，進一步組間比較采用SNK?q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DCA對T24細胞克隆增殖能力的影響 實驗組5、10、20 mmol/L濃度的每孔細胞克隆形成數(shù)量分別為（292.3 ± 20.5）個/孔、（178.7 ± 17.2）個/孔和（122.3±9.6）個/孔，明顯低于對照組（416.3±12.6）個/孔，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

2.2 DCA對T24細胞遷移活性的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，在5、10、20 mmol/L濃度的DCA作用24、48、72 h后，細胞遷移率呈現(xiàn)不同程度地降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖2。

圖1 兩組細胞克隆形成數(shù)量比較Fig.1 Comparison of the number of clones formed in the two groups

圖2 細胞劃痕實驗檢測兩組細胞遷移能力（×100）Fig.2 Cell scratches were used to detect the migration ability of the two groups（× 100）

2.3 DCA對T24細胞侵襲活性的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示：實驗組用5、10、20 mmol/L DCA處理24 h后侵襲細胞數(shù)分別為（361.7±20）個/視野、（165.0 ± 17.1）個/視野、（71.0 ± 16.1）個/視野，均低于對照組的（536.7±27.6）個/視野，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 DCA 對 E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及Slug的mRNA表達的影響 實驗組用5、10、20 mmol/L DCA處理T24細胞48 h后，細胞中E?cadherin mRNA表達水平均高于對照組，而Snail、Slug、vimentin和N?cadherin mRNA表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組細胞的遷移率比較Tab.1 Comparison of the mobility of the two groups±s

表1 兩組細胞的遷移率比較Tab.1 Comparison of the mobility of the two groups±s

注：與對照組比較，*P＜0.01

組別實驗組5 mmol/L 10 20對照組24 h 48 h 72 h 34.6±2.2*25.4±1.2*21.4±1.5*54.2±1.7 52.1±1.2*34.0±1.7*30.0±1.3*63.4±1.9 63.2±1.3*58.4±1.1*41.6±1.0*80.1±1.6

圖3 Transwell檢測兩組細胞侵襲細胞數(shù)（×100）Fig.3 The number of invading cells were detected by Transwell in both groups（× 100）

表2 兩組間mRNA相對表達量的比較Tab.2 Comparison of mRNA expression between the two groups ±s

表2 兩組間mRNA相對表達量的比較Tab.2 Comparison of mRNA expression between the two groups ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

E?cadherin N?cadherin vimentin Snail Slug 組別實驗組5 10 20對照組1.57±0.13*2.11±0.09*3.35±0.14*1.00±0.00 0.72±0.11*0.68±0.15*0.52±0.08*1.00±0.00 0.88±0.09*0.62±0.15*0.48±0.13*1.00±0.00 0.86±0.08*0.75±0.11*0.61±0.13*1.00±0.00 0.84±0.12*0.67±0.13*0.62±0.07*1.00±0.00

圖4 Western blot檢測兩組細胞的EMT標記蛋白的表達Fig.4 The expression of EMT marker protein was detected by Western blot

2.5 DCA 對 E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及Slug的蛋白表達的影響 實驗組用5、10、20 mmol/L DCA處理T24細胞48 h后，細胞中E?cadherin蛋白表達水平均高于對照組，而Snail、Slug、vimentin和N?cadherin蛋白表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4和表3。

3 討論

能量代謝異常是惡性腫瘤最鮮明的特征之一，尤其是糖代謝異常，其中有氧糖酵解是惡性腫瘤能量代謝方面的最主要特征，即腫瘤細胞在充足的有氧條件下仍然優(yōu)先通過糖酵解方式獲取能量［7-8］，其生產(chǎn)的大量中間產(chǎn)物為腫瘤生長侵襲遷移提供幫助。DCA，又稱二氯醋酸，是一種小分子代謝調(diào)節(jié)劑，臨床上用于治療乳酸中毒和線粒體遺傳性疾病，其藥理作用機制為通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）活性，上調(diào)丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）活性，促進丙酮酸進入三羧酸循環(huán)從而減少乳酸生成［9］，從而抑制腫瘤細胞生長，但對正常細胞卻無損害。近年來研究發(fā)現(xiàn)DCA具有明顯抗腫瘤活性，但對于DCA作用于膀胱癌T24細胞的克隆形成、侵襲及遷移的影響在國內(nèi)外卻鮮有報道。因此，我們探討DCA對膀胱癌T24細胞克隆形成、侵襲和遷移的影響，為逆轉(zhuǎn)膀胱癌轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

本研究表明，DCA能夠明顯抑制體外培養(yǎng)的膀胱癌T24細胞的克隆形成，推測DCA可能通過抑制膀胱癌T24細胞PDK激活PDH，從而改變膀胱癌細胞糖代謝途徑，使癌細胞從依賴糖酵解獲得能量向依賴氧化磷酸化獲能發(fā)生轉(zhuǎn)化。

細胞劃痕實驗顯示，與對照組相比發(fā)現(xiàn)，實驗組隨DCA的濃度的增加和時間的延長，細胞遷移的總體寬度明顯較對照組大。結(jié)合Transwell結(jié)果，實驗組與對照組的侵襲細胞數(shù)相比，前者比后者明顯減少，且呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示DCA可以抑制T24細胞的侵襲能力，與細胞劃痕實驗結(jié)果相一致。

不同腫瘤細胞的發(fā)病機制不盡相同，但研究證實EMT是上皮源性腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，與腫瘤細胞發(fā)生遷移和侵襲密切相關［2，10］。典型的EMT是指上皮細胞失去上皮特性，向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為細胞間連接減少，從而增強癌細胞的侵襲及遷移能力，其主要特征為上皮標記物E?cadherin表達的減少，間質(zhì)標記物vimentin和N?cadherin表達的增加［10-11］。Snail家族（包括Snail和Slug）是具有負調(diào)控作用的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能夠與E?cadherin相互作用，從而抑制 E?cadherin的表達［12］。大量研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌的侵襲遷移與EMT密切相關，主要通過上調(diào)E?cadherin表達的同時，下調(diào)vimentin和N?cadherin表達，從而抑制膀胱癌細胞的侵襲遷移能力［2，13-14］。在臨床研究方面同樣發(fā)現(xiàn)EMT與膀胱癌患者密切相關，HENSLEY等［2］研究發(fā)現(xiàn)EMT與膀胱癌患者的臨床病理分級分期及預后密切相關，認為EMT的特征性標記物可作為浸潤性膀胱癌的潛在的腫瘤標記物。同時，SINGH等［15］研究認為EMT標記物可作為判斷膀胱癌患者預后的一個有效的敏感性腫瘤標記物。本研究發(fā)現(xiàn)，DCA能夠抑制T24細胞的侵襲遷移，但其機制尚未明確，所以我們探討DCA抑制T24細胞侵襲遷移是否與EMT相關標記物的改變有關。

表3 兩組間蛋白相對表達水平（灰度值）Tab.3 between the two groups of protein relative expression level（gray value） x±s

本研究通過Real time PCR法及Western blot法檢測 EMT相關標記物 E?cadherin、N?cadherin、vimentin、Snail及Slug表達水平。Real time PCR結(jié)果顯示：實驗組T24細胞的E?cadherin表達上升，而Snail、Slug、vimentin和N?cadherin表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。這一結(jié)果，在Western blot檢測蛋白的表達情況也得到驗證。因此，我們推斷DCA通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達，進而促進E?cadherin的表達，同時減少間質(zhì)細胞標記物vimentin和N?cadherin的表達，抑制T24細胞發(fā)生EMT，降低膀胱癌細胞侵襲遷移的能力。但關于DCA抑制膀胱癌T24細胞的增殖、侵襲及遷移的確切分子機制還有待進一步研究，本課題組擬建立惡性腫瘤的裸鼠移植模型，進一步探討DCA在動物水平的抗腫瘤效應。

綜上所述，本研究應用DCA處理T24細胞，通過對T24細胞克隆形成能力、細胞侵襲力及遷移能力的觀察，認為DCA可抑制T24細胞克隆形成能力，且對腫瘤的侵襲和遷移能力也有明顯的抑制作用，其機制可能通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達，進而促進E?cadherin的表達，同時減少間質(zhì)細胞標記物vimentin和N?cadherin的表達，抑制T24細胞發(fā)生EMT，降低膀胱癌細胞侵襲遷移的能力。

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