陳益耀 陳軼 何周桃 蔡曼妮

海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科（海南?？?570311）

非酒精性脂肪肝（non?alcoholic fatty liver dis?ease，NAFLD）為肝臟內(nèi)的甘油三酯聚集引起的肝臟性疾病。胰高血糖素樣肽1（glucagon?like pep?tide 1，GLP?1）為內(nèi)源性腸促胰島素，可以提高胰腺β細(xì)胞的葡萄糖濃度分解胰島素。據(jù)相關(guān)研究顯示，人體的肝細(xì)胞內(nèi)有GLP?1的受體，在Huh7的干細(xì)胞株培養(yǎng)液內(nèi)添加GLP?1的受體后脂肪的產(chǎn)生會減少。利拉魯肽是GLP?1的高度同源的類似物，和人體內(nèi)GLP?1有96%序列的同源性。它可以讓葡萄糖濃度的依賴模式來增加胰島素的分解［1-2］。當(dāng)體內(nèi)血糖變高時，刺激胰島素的分泌，胰高糖素的分泌被抑制。當(dāng)血糖變低時，利拉魯肽可以使胰島素的分泌變少，且胰高糖素分泌不會受到影響。近期相關(guān)研究顯示TLR4在炎癥細(xì)胞中有表達(dá)，特別是在肝臟祖細(xì)胞、門靜脈的巨噬細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)最為顯著，它和肝臟炎癥反應(yīng)聯(lián)系緊密，還可以活化纖維化細(xì)胞。TLR4信號通路中有完整的表達(dá)，其中TLR4/NF?κB分支在NAFLD進(jìn)展中起著重要作用，它調(diào)控肝臟的炎癥反應(yīng)、纖維化進(jìn)程和肝細(xì)胞的凋亡［3］。因此，更進(jìn)一步地研究藥物對肝臟中TLR4/NF?κB信號通路的影響有利于了解藥物對NAFLD進(jìn)展影響。所以，本文對NAFLD大鼠模型用利拉魯肽進(jìn)行治療，研究GLP?1對于NAFLD大鼠肝功能的影響，并研究其對TLR4/NF?κB的信號通路影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5周齡的SD老鼠45只，體質(zhì)量（110±20）g，由上海斯萊克動物實驗有限公司提供。

1.2 實驗試劑和儀器 主要試劑：利拉魯肽（丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)）、甘油三酯試劑（北京中生北控生物科技公司生產(chǎn)）、膽固醇試劑（北京中生北控生物科技公司生產(chǎn)）、BCA蛋白濃度測定制劑（碧云天公司生產(chǎn)）、高脂飼料（廣東動物實驗中心生產(chǎn)）。

主要儀器：蘇州凈化設(shè)備廠的超凈工作臺、低溫臺式離心機、MPG?13H的水浴箱、分光的光度計、制冰機、電泳儀、全自動的生化分析儀、德國Eppendorf 100～1 000 μL的可調(diào)微量移液器。

1.3 實驗方法 將45只大鼠隨機分成兩組，正常飼料喂養(yǎng)15只，高脂飲食（普通飼料+100 g/kg豬油+20 g/kg膽固醇+100 g/kg蔗糖）喂養(yǎng)30只使其形成NAFLD模型。檢測血清肝酶、血清TG、TC異常升高，肝組織HE染色有大量脂滴形成者可診斷為NAFLF造模成功。

在第10周，把高脂飼料喂養(yǎng)的28只老鼠隨機分成兩組，模型對照組（14只）和GLP?1干預(yù)組（14只）；正常飼料喂養(yǎng)的15只為正常對照組。

正常對照組：正常飼料喂養(yǎng)并每天在腹腔內(nèi)注射0.7 mg/kg的生理鹽水，持續(xù)4周；模型對照組：高脂的飼料喂養(yǎng)并每天在腹腔內(nèi)注射0.7 mg/kg的生理鹽水，持續(xù)4周；GLP?1干預(yù)組，高脂的飼料喂養(yǎng)并每天在腹腔內(nèi)注射0.7 mg/kg的利拉魯肽，持續(xù)4周。期間查看大鼠的活動、體質(zhì)量、食欲、大小便等情況的變化。

1.4 指標(biāo)檢查 肝指數(shù)計算：肝指數(shù)（%）=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。肝功能和血脂的檢查：采用全自動的生化檢測儀檢查總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）。肝組織的蛋白含量檢查：使用BCA法［4］測定微量的蛋白濃度；RT?PCR的方法［5］檢查TLR4 mRNA的表達(dá)；Western blot法［6］檢查TLR4的蛋白表達(dá)；免疫組化法［8］檢查肝組織中NF?κB表達(dá)情況；

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計的軟件來分析，計數(shù)資料使用表示，多組間對比使用單因素方差分析，方差齊者使用LSD檢驗，方差不齊者使用Welch校正法，計數(shù)資料使用Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 在干預(yù)的過程中，正常對照組大鼠活動良好，皮毛整潔，飲食也正常；模型對照組的大鼠飲食變多，毛發(fā)變得凌亂，活動變少；GLP?1干預(yù)組的大鼠與正常對照組相似。

2.2 3組大鼠在肝指數(shù)、肝重量和體質(zhì)量的變化情況 與正常對照組相比，模型對照組大鼠的肝指數(shù)和肝質(zhì)量明顯升高（P＜0.05），與模型對照組對比，用藥4周后，GLP?1組大鼠的肝指數(shù)和肝重量明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠的肝指數(shù)、肝重量和體質(zhì)量變化情況對比Tab.1 The changes of liver index，liver weight and body mass in three groups of rats ±s

表1 三組大鼠的肝指數(shù)、肝重量和體質(zhì)量變化情況對比Tab.1 The changes of liver index，liver weight and body mass in three groups of rats ±s

組別正常對照組模型對照組GLP?1干預(yù)組F值P值例數(shù)15 14 14大鼠體質(zhì)量（g）359.93±50.02 355.72±35.74 355.41±22.63 2.894 0.632大鼠肝質(zhì)量（g）7.94±1.31 12.04±1.27 8.97±1.29 2.105 0.026大鼠肝指數(shù)（%）22.91±1.49 31.03±3.51 26.85±3.17 1.671 0.031

2.3 3組大鼠血清肝功能及血清脂質(zhì)變化情況與正常對照組相比，模型對照組中AST、ALT、TC、TG均明顯上升（P＜0.05）；與模型對照組相比，GLP?1干預(yù)組在用藥4周后，AST、ALT、TC、TG均明顯下降（P＜ 0.05），見表2。

2.4 3組大鼠的病理改變情況 正常組大鼠肝臟的結(jié)果正常，肝小葉的結(jié)構(gòu)顯著，肝細(xì)胞索呈現(xiàn)出放射狀的排列，細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)氣球樣的變性。模型組大鼠肝細(xì)胞重度水樣變性、彌漫小泡性脂肪空泡變性，且細(xì)胞核被擠壓變形，肝細(xì)胞索混亂，肝竇變狹窄或者消失，但沒有發(fā)現(xiàn)明顯的壞死、炎癥和纖維化等狀況。GLP-1干預(yù)組大鼠肝臟組織能夠看見少量的脂肪水樣變性，程度比模型對照組輕，見圖1。

表2 3組大鼠血清肝功能及血清脂質(zhì)變化情況比較Tab.2 Comparison of serum liver function and serum lipid in three groups of rats ±s

表2 3組大鼠血清肝功能及血清脂質(zhì)變化情況比較Tab.2 Comparison of serum liver function and serum lipid in three groups of rats ±s

組別正常對照組模型對照組GLP?1干預(yù)組F值P值例數(shù)15 14 14 ALT（U/L）66.92±18.02 86.94±18.83 58.96±16.04 0.741 0.036 AST（U/L）97.74±45.05 175.74±29.71 123.69±25.06 0.964 0.021 TC（mmol/L）1.12±0.31 2.51±0.32 1.99±0.18 0.163 0.014 TG（mmol/L）0.60±0.17 1.96±0.81 1.32±0.46 0.904 0.032

圖1 肝組織HE染色觀察（×200）Fig.1 Liver tissue HE staining（× 200）

2.5 3組大鼠TLR4 mRNA表達(dá)、TLR4蛋白表達(dá)和NF?κB蛋白表達(dá)情況 由RT?PCR的結(jié)果顯示，模型對照組和正常對照組對比，模型對照組mRNA的表達(dá)上升（P＜0.05），GLP?1干預(yù)組和模型對照組對比，GLP?1干預(yù)組mRNA的表達(dá)降低（P＜0.05）；Western blotting法檢查結(jié)果顯示（圖2），與正常對照組比較，模型對照組的TLR4表達(dá)上升（P＜0.05），GLP?1干預(yù)組和模型對照組比較，TLR4的表達(dá)降低（P＜0.05）；免疫組化檢測顯示（圖3），與正常對照組比較，模型對照組NF?κB的表達(dá)上升（P＜0.05），與模型對照組比較，GLP?1干預(yù)組NF?κB的表達(dá)降低（P＜0.05），見表3。

圖2 TLR4蛋白表達(dá)條帶圖Fig.2 TLR4 protein expression band map

3 討論

NAFLD為代謝綜合征在肝臟上的表現(xiàn)，它是引發(fā)慢性肝病主要原因。約25%的NAFLD患者會演變?yōu)槁愿窝?，與肝臟腫瘤、肝硬化及門脈高壓都有關(guān)系?，F(xiàn)在此病的發(fā)病率逐步上升，但NAFLD演變?yōu)槁愿窝讬C制仍不明確［7］。肝臟內(nèi)TAG分解代謝的過程中主要是脂肪酸氧化及以極低密度脂蛋白的形式轉(zhuǎn)運出肝細(xì)胞。無論是進(jìn)食或者空腹，肝臟代謝所需的能量大部分均來自脂肪酸氧化，而該過程與肝臟的脂肪變性密切相關(guān)。相關(guān)研究認(rèn)為腸道細(xì)菌會影響一些炎癥受體TLR4、TLR9等通過門脈系統(tǒng)進(jìn)入到肝臟導(dǎo)致肝臟炎癥，所以通過扭轉(zhuǎn)宿主和腸道菌群關(guān)系調(diào)整炎癥受體表達(dá)可以扭轉(zhuǎn)代謝性障礙導(dǎo)致肝臟炎癥。NF?κB為多效性蛋白復(fù)合體，它在胞漿內(nèi)是以沒有活性形式而存在，與NF?κB抑制劑聯(lián)合在一起。當(dāng)受到細(xì)胞外面復(fù)雜信號作用，抑制劑會降解，NF?κB就以有活性形式進(jìn)到細(xì)胞核內(nèi)，這是可激活轉(zhuǎn)錄［8-9］。NF?κB激活在肝纖維化和肝臟炎癥發(fā)展中有重要作用，它可保護(hù)肝臟細(xì)胞不受炎性因子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，與補償肝細(xì)胞增殖反應(yīng)來修復(fù)肝部損壞［10］。

表3 3組大鼠TLR4 mRNA表達(dá)、TLR4蛋白表達(dá)和NF?κB蛋白表達(dá)情況比較Tab.3 TLR4 mRNA expression，TLR4 protein expression and NF?κB protein expression in three groups ±s

表3 3組大鼠TLR4 mRNA表達(dá)、TLR4蛋白表達(dá)和NF?κB蛋白表達(dá)情況比較Tab.3 TLR4 mRNA expression，TLR4 protein expression and NF?κB protein expression in three groups ±s

組別正常對照組模型對照組GLP?1干預(yù)組F值P值例數(shù)15 14 14 mRNA 1.15±0.24 2.87±0.31 1.04±0.23 2.781 0.016 TLR4蛋白表達(dá)1.02±0.21 1.93±0.17 1.15±0.19 1.756 0.024 NF?κB蛋白表達(dá)8.23±1.72 62.51±10.73 24.77±5.83 1.904 0.012

本文經(jīng)過高脂喂養(yǎng)建立了NAFLD的大鼠模型，表現(xiàn)出高脂血癥。使用GLP?1的類似物（利拉魯肽）進(jìn)行4周的治療后，GLP?1干預(yù)組和模型對照組比較，其肝功能ALT、AST，血清TG、TC都明顯降低，和正常對照組接近。由此發(fā)現(xiàn)GLP?1類似物可以明顯改善高脂飲食導(dǎo)致脂質(zhì)代謝絮亂，對NAFLD大鼠可起到治療作用，它主要是通過調(diào)整肝臟糖代謝扭轉(zhuǎn)了胰島素抵抗實現(xiàn)的。如果TLR4/NF?κB信號通路是炎癥傳播重要通道，那么GLP?1類似物對通路是不是有影響？經(jīng)過本文研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型對照組大鼠體內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)和NF?κB蛋白表達(dá)明顯上升，與模型對照組比較，GLP?1干預(yù)組大鼠體內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)和NF?κB蛋白表達(dá)明顯降低。由此認(rèn)為GLP?1類似物（利拉魯肽）能夠有效降低高脂飲食誘導(dǎo)高表達(dá)炎癥信號路通TLR4和NF?κB蛋白表達(dá)，對體內(nèi)炎癥內(nèi)在機制有抑制作用。本文研究的對象是動物，所取標(biāo)本為動物組織標(biāo)本和人體的病理機制有一定差距，人體有效的臨床研究有待進(jìn)行，方可進(jìn)一步驗證利拉魯肽在人體內(nèi)對NAFLD的治療作用。

圖3 肝組織免疫組化結(jié)果（×200）Fig.3 Immunohistochemical results of liver tissue（× 200）

綜上所述，GLP?1可明顯扭轉(zhuǎn)NAFLD大鼠的糖脂代謝絮亂和肝功能受損的情況，GLP?1可明顯降低大鼠肝組織中TLR4和NF?κB的蛋白表達(dá)，是降低NAFLD的大鼠肝組織內(nèi)炎癥水平重要的機制之一。

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