戴燕 金世光 王薛潔 楊鑫泉 王大新

江蘇省蘇北人民醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，2急診科（江蘇揚(yáng)州 225001）

卵巢惡性腫瘤的發(fā)生率及病死率有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，其預(yù)后差、致死率高［1-4］。卵巢癌細(xì)胞中促生長(zhǎng)因子TGF?β、EGF與其受體在卵巢癌中過(guò)表達(dá)并能激活下游信號(hào)通路，是癌細(xì)胞發(fā)生EMT的重要信號(hào)，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［5-6］。有文獻(xiàn)報(bào)道RNA結(jié)合蛋白Larp1在上皮性腫瘤細(xì)胞中對(duì)mTOR mRNA的翻譯起始有重要調(diào)控作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除Larp1蛋白能明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因此推測(cè)Larp1表達(dá)與腫瘤發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［7-10］。Larp1 可與 PABP、啟動(dòng)子elF4E形成聚合體，同時(shí)能與前多聚核糖體亞基60S和80S結(jié)合，在RNA轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11-12］。在前期研究基礎(chǔ)上，本文擬通過(guò)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中Larp1與促生長(zhǎng)因子對(duì)Larp1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Larp1對(duì)EMT轉(zhuǎn)化與卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用，將為診斷治療卵巢癌提供新的生物標(biāo)記與治療方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體 10%胎牛血清RPMI?1640培養(yǎng)液（Sigma?Aldrich）。Western Blotting實(shí)驗(yàn)使用抗體Larp1（Strategic Diagnostic）與 β ?tubulin（Sigma?Al?drich），二抗 Anti?rabbit?HRP（Glostrup）、Anti?rat?HRP（Santa Cruz），稀釋比例均為1∶5 000。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中Larp1抗體稀釋比例為1∶100，Alexa?Fluor 488（Invitrogen）稀釋比例為1∶500。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI?1640培養(yǎng)基（含有10%FCS）（Invitrogen）并放置于5%CO2/37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建DNA質(zhì)粒載體 GFP?Larp1從OriGene（Rockville）購(gòu)入，pCDNA/GW?53/CAT（Invitrogen）在后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中作為空載體質(zhì)粒組。Gateway T?RexTM的表達(dá)體系用于構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Larp1過(guò)表達(dá)的SKOV?3細(xì)胞。Larp1基因成功克隆至pT?RExTM?DEST?30（Invitrogen）。

1.2.3 Larp1在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè) 細(xì)胞溶解于裂解液后用PBS清洗兩次，加入200 μL裂解液，4℃離心10 min。通過(guò)BCA法（Thermo Scientific）確定濃度并稀釋后使用SDS?PAGE電泳法分離并轉(zhuǎn)膜（BioRad），接著在5%的脫脂牛奶（溶于 0.05%PBS?T）（Sigma?Aldrich）恒溫封閉1 h（37℃）；加入一抗4℃孵育過(guò)夜；PBS?T漂洗3次，每次5 min；加二抗后37 ℃孵育2 h，PBS?T漂洗3次，每次5 min；ECL（Millipore）顯影，暗室壓片。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有GFP?Larp1的DNA質(zhì)粒 SKOV?3與OVCAR?3細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)轉(zhuǎn)移至6孔板，LipofectamineTM（Invitrogen）或者Effectene?（Qiagen）為溶劑。OVCAR?3分別轉(zhuǎn)染0.5、1、2 μg DNA（GFP?Larp1）質(zhì)粒，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照組。另外SKOV?3細(xì)胞也如上轉(zhuǎn)染1與 2 μg DNA（GFP?Larp1）質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)染0.5、1 、2 μg DNA（pT?REx?Larp1），轉(zhuǎn)染24 h后獲得細(xì)胞裂解物。

1.2.5 免疫熒光染色 在六孔板中放置蓋玻片并培養(yǎng)SKOV?3細(xì)胞，接著室溫下加入PHEM固定10 min后加入PBSTB封閉1 h，再加入一抗孵育過(guò)夜。細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次PBS清洗后，加入Alexa Fluor?488（Invitrogen）孵育1 h，再PBS漂洗3次后封片。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡 蛋白樣品熒光染色后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems）觀察并獲取圖像，ImageJ軟件處理圖像（NIH）。

1.2.7 3D趨化侵襲實(shí)驗(yàn) TGF?β（Invitrogen）、bF?GF（Invitrogen）、EGF（Promega）、PBS 加入MatrigelTM。液狀MatrigelTM（40 μL）加入Chamber Slides在37 ℃下聚合20 min。GFP?Larp1轉(zhuǎn)染與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)夜后培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿中（5×103細(xì)胞）。4 h后更換為降血清培養(yǎng)液。MatrigelTM侵襲細(xì)胞15 min后固定并染色（轉(zhuǎn)染48 h后），GFP?Larp1表達(dá)細(xì)胞與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞由AlexaFluor?568和Alexa Fluor?488染色，其余步驟均按照之前所述重復(fù)。

1.2.8 定點(diǎn)趨化侵襲實(shí)驗(yàn) 在液狀MatrigelTM（BD）基底膜內(nèi)分別加入TGF?β（0.3 ng/μL）、EGF（3 ng/μL）、bFGF（3 ng/μL）、PBS（對(duì) 照 組）。MatrigelTM在37 ℃下聚合15 min，OVCAR?3與SKOV?3細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至100 mm培養(yǎng)皿中（7×105細(xì)胞），轉(zhuǎn)染48 h后觀察侵襲細(xì)胞數(shù)量（Nikon）。

1.3 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Larp1蛋白在各卵巢癌細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)與分布Fig.1 The localization and endogenous expression of Larp1 in ovarian cancer cells

2 結(jié)果

2.1 Larp1在OVCAR?3與SKOV?3內(nèi)表達(dá)水平最低且分布于細(xì)胞核內(nèi) Western Blot結(jié)果顯示SKOV?3與OVCAR?3的Larp1蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低（圖1A），因此選取OVCAR?3與SKOV?3進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。另外免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Larp1主要集中分布于SKOV?3細(xì)胞核內(nèi)（圖1B）。

2.2 在OVCAR?3與SKOV?3內(nèi)轉(zhuǎn)染GFP?Larp1質(zhì)粒使其過(guò)表達(dá) 如圖2A所示，在使用10%SDS?PGGE分離蛋白時(shí)Larp1與GFP?Larp1（150 kDa）較難區(qū)分，因此進(jìn)一步用8%SDS?PGGE分離蛋白。當(dāng) 0.5 μg DNA轉(zhuǎn)染到OVCAR?3細(xì)胞且DNA與LipofectamineTM轉(zhuǎn)染濃度比為1∶1.5時(shí)，轉(zhuǎn)染效果最優(yōu)（圖2B）。SKOV?3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2 μg DNA 且比例為1∶2時(shí)，GFP?Larp1表達(dá)量最高（圖2C）。當(dāng)2 μg DNA：Effectene?溶劑為1∶1.25時(shí)，轉(zhuǎn)染結(jié)果最理想，沿用此比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2D）。

圖2 優(yōu)化GFP?Larp1 DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度Fig.2 Transfection optimisation for Larp1 DNA constructs

圖3 OVCAR?3細(xì)胞在3D侵襲實(shí)驗(yàn)中形態(tài)變化Fig.3 OVCAR?3 cells in 3D invasion

2.3 通過(guò)3D細(xì)胞侵襲法檢測(cè)Larp?1胞內(nèi)定位與分布 研究結(jié)果顯示在MatrigelTM中加入誘導(dǎo)EMT的促生長(zhǎng)因子，OVCAR?3細(xì)胞通常位于MatrigelTM表面，且未發(fā)現(xiàn)明顯突觸伸入基底膜膠。而相比于沒(méi)有生成突觸的細(xì)胞，那些生成伸入基底膜膠突觸的細(xì)胞或者已經(jīng)大部分嵌入基底膜膠的細(xì)胞呈近圓形（圖3A、C）。在促生長(zhǎng)因子與PBS誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞易聚集且有些表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞形態(tài)（圖4A）。此外，Larp1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而在空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)（PBS干預(yù)）Larp1分布在細(xì)胞核內(nèi)（圖4B）。轉(zhuǎn)染GFP?Larp1的SKOV?3細(xì)胞在TGF?β/MatrigelTM內(nèi)侵入基底膜最深，集體遷移現(xiàn)象最明顯，細(xì)胞內(nèi)Larp1表達(dá)水平最高，細(xì)胞內(nèi)均生成長(zhǎng)肌動(dòng)蛋白突觸，深入MatrigelTM內(nèi)同時(shí)Larp1與圓形突觸共定位（圖4C、D）。

2.4 Larp1蛋白過(guò)表達(dá)會(huì)提高OVCAR?3與SKOV?3細(xì)胞侵襲能力 本研究采用定點(diǎn)趨化實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)GFP?Larp1過(guò)表達(dá)與空載體轉(zhuǎn)染的OVCAR?3與SKOV?3細(xì)胞對(duì)基底膜膠的侵襲能力差異，發(fā)現(xiàn)隨著位置的外移降低濃度，細(xì)胞會(huì)向濃度高的中間位置侵襲（圖5A），同時(shí)20×物鏡觀察GFP?Larp1轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖5B）。從細(xì)胞對(duì)基底膜膠的不同扭曲程度可以推論SKOV?3比OVCAR?3細(xì)胞侵略性更強(qiáng)（圖5C）。另外結(jié)果顯示在PBS中，GFP?Larp1過(guò)表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比趨化侵襲反應(yīng)無(wú)明顯區(qū)別。而在bFGF干預(yù)下，OVCAR?3細(xì)胞過(guò)表達(dá)Larp1后趨化侵襲現(xiàn)象十分明顯，其他未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞趨化侵襲數(shù)量在bFGF、EGF、TGF?β環(huán)境下并未表現(xiàn)出明顯區(qū)別（圖5C與D）。此外，轉(zhuǎn)染GFP?Larp1的SKOV?3細(xì)胞對(duì)bFGF的趨化侵襲比轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒細(xì)胞更明顯（P=0.07）（圖5D）。

圖4 SKOV?3細(xì)胞在3D侵襲實(shí)驗(yàn)中形態(tài)變化Fig.4 SKOV?3 cells in 3D invasion

圖5 定點(diǎn)趨化侵襲檢測(cè)Fig5 Spot chemoinvasion assay

3 討論

卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌致死率居高不下的主要原因，Larp1表達(dá)上調(diào)后對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的EMT及侵襲轉(zhuǎn)移有正調(diào)控作用［8，12］。為了進(jìn)一步探討Larp1在卵巢腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用，本研究首先通過(guò)3D侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVCAR?3細(xì)胞內(nèi)GFP?Larp1與Larp1在細(xì)胞邊緣形成泡狀肌動(dòng)蛋白突觸，而SKOV?3細(xì)胞在TGF?β/MatrigelTM中有應(yīng)力纖維生成并與Larp1共定位。同時(shí)GFP?Larp1高表達(dá)的SKOV?3細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白突觸高度集中并延展，突觸形成最多。這些突觸與板狀偽足形成、附著底層等過(guò)程都有直接關(guān)系，Larp1與突觸共定位證明Larp1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)有重要作用。最后定點(diǎn)趨化侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Larp1的OVCAR?3與SKOV?3細(xì)胞對(duì)促生長(zhǎng)因子的趨化侵襲現(xiàn)象比對(duì)照組更明顯，推測(cè)Larp1與促生長(zhǎng)因子可能通過(guò)相互作用促進(jìn)EMT并增強(qiáng)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。綜上所述Larp1過(guò)表達(dá)能通過(guò)與促生長(zhǎng)因子間的相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，同時(shí)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白突觸形成增強(qiáng)卵巢惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，但其具體分子機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明，這將為卵巢腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的生物標(biāo)記與治療方向。

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