張 悅，苑夢(mèng)偉，劉開陽，張 靜，呂雅潔，李凌軒，劉 偉

(1河北醫(yī)科大學(xué),2河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,河北省重大疾病的免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊050017)

0 引言

在1972年,Owen首次利用掃描電鏡觀察到人淋巴濾泡表面有一種特殊的細(xì)胞,因其表面沒有致密的微絨毛,取而代之的是豐富的微褶皺,故稱之為微褶皺細(xì)胞(microfold cell,M cell),也有人稱之為膜性細(xì)胞(membranous cell,M cell),簡稱為M細(xì)胞。完全分化的M細(xì)胞的基底部細(xì)胞膜向頂部突起,細(xì)胞內(nèi)凹形成特有的“袋形囊腔”［1］,呈口袋狀。M細(xì)胞具有攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)抗原的功能,且現(xiàn)階段大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其不具備加工提呈功能。M細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)可分為三個(gè)階段,這是一個(gè)高效、快速的過程。M細(xì)胞對(duì)微粒的捕獲機(jī)制可基于其性質(zhì)分為兩種,在本文予以詳述。針對(duì)M細(xì)胞的體內(nèi)培養(yǎng)和原位培養(yǎng)的問題,學(xué)者們建立了多種體外模型輔助理解。凝集素在細(xì)胞識(shí)別和粘著反應(yīng)中起重要作用,主要是促進(jìn)細(xì)胞間的粘著。這一特性可以輔助M細(xì)胞對(duì)于抗原的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)于凝集素和M細(xì)胞之間聯(lián)系的研究可以為疫苗的研究提供方向。研究表明,SIgA選擇性的捆綁和吸收的機(jī)制為帶有循環(huán)核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP2的特殊配體結(jié)合于表達(dá)在細(xì)胞表面的mGP2。而GP2可以作為位于M細(xì)胞上的細(xì)菌抗原的轉(zhuǎn)錄受體,參與對(duì)一些特定細(xì)菌的黏膜免疫應(yīng)答,這為研發(fā)抗菌藥提供新思路。

本文將詳細(xì)論述M細(xì)胞與以下疾病的聯(lián)系?？肆_恩氏病是胃腸道炎癥性疾病,病變始于含有M細(xì)胞的淋巴樣濾泡相關(guān)上皮(follicle-associated epithelium,FAE)［2］。肉毒毒素與無毒成分一起組成祖毒素復(fù)合物(PTCs)。L-PTC與血凝素(hemagglutinin,HA)和GP2相互作用,通過M細(xì)胞傳遞到基底外側(cè)表面,這對(duì)食源性肉毒中毒的發(fā)病起著主導(dǎo)作用［3］。白色念珠菌通過M細(xì)胞進(jìn)入腸細(xì)胞層有兩條途徑［4］。M細(xì)胞運(yùn)輸?shù)寞偱２〔≡w是人類變異型克雅氏病發(fā)病的重要因素［5］。發(fā)炎結(jié)腸中M細(xì)胞有可能被誘導(dǎo)產(chǎn)生,則M細(xì)胞有可能成為臨床診斷結(jié)腸炎的表征之一［6］。

M細(xì)胞的特異機(jī)制具有為黏膜免疫系統(tǒng)提供藥物或疫苗的潛力,疫苗接種是M細(xì)胞免疫學(xué)最成功的應(yīng)用之一,M細(xì)胞靶向疫苗可以誘導(dǎo)有效黏膜免疫、保護(hù)病毒性心肌炎以及增強(qiáng)黏膜SIgA反應(yīng)。相比于其他疫苗來說,口服疫苗有許多優(yōu)點(diǎn),在本文章中我們對(duì)其進(jìn)行了介紹。

1 M細(xì)胞的頂端形態(tài)

研究表明,M細(xì)胞的表面特征主要是微絨毛缺失,這在非特異性捕獲腸腔粒子中起主要作用。M細(xì)胞基底部細(xì)胞膜向頂部突起,細(xì)胞內(nèi)凹形成特有的“袋形囊腔”,這一結(jié)構(gòu)縮短了轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡內(nèi)抗原由腸腔面到基底膜表面的距離。在各種各樣的實(shí)驗(yàn)中,David等［7］觀察到獨(dú)特的M細(xì)胞表型的特點(diǎn)是被誘導(dǎo)后其頂端表面有一種黏膜“捕蠅紙”,它能夠捕捉任何類型的腔內(nèi)顆粒。

M細(xì)胞在頂端表面表達(dá)大量的免疫監(jiān)視受體,一系列分子經(jīng)由這些受體將腔內(nèi)抗原最終傳遞到黏膜下層淋巴組織［8］。因此,腔內(nèi)抗原可通過識(shí)別被其利用的分子入侵M細(xì)胞［8］。例如GP2、PrPC(prion protein,細(xì)胞朊蛋白 )、C5aR(C5a receptor,C5a受體)和其他特定分子。上文提到的GP2在M細(xì)胞的頂端膜上高度表達(dá),可以作為細(xì)菌抗原的轉(zhuǎn)錄受體,尤其是與大腸桿菌(Escherichia coli)和血清型傷寒桿菌(S.Typhmurium)結(jié)合［1］。GP2還與肉毒桿菌神經(jīng)毒素的血凝素A1結(jié)合,增加了肉毒桿菌［9］的易感性［10］。目前已有證據(jù)表明,在M細(xì)胞頂端質(zhì)膜腔側(cè)上高度表達(dá)的PrPC可以通過增強(qiáng)流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)或其他外源性抗原的胞吞作用來促進(jìn)粘膜免疫監(jiān)測(cè)［11］。值得注意的是,尿素調(diào)節(jié)素在上皮細(xì)胞的M細(xì)胞中也有特異性表達(dá)并有可能作為一種微生物吸收受體,但還需要詳細(xì)的研究來證實(shí)這一觀點(diǎn)［12］。

2 M細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)抗原

2.1 M細(xì)胞捕獲顆粒的兩種機(jī)制 可溶性蛋白抗原與抗原顆粒具有形態(tài)上的區(qū)別,例如蛋白質(zhì)分子和細(xì)菌之間存在差別,所以它們必須以不同的方式被捕獲。M細(xì)胞可以通過兩種不同的機(jī)制來捕獲顆粒：基于相關(guān)配體的俘獲受體的捕獲與基于生物粒子的物理化學(xué)性質(zhì)的捕獲。

已有報(bào)道稱可使用特定的“捕獲受體”進(jìn)行M細(xì)胞的微生物捕獲,這種受體包括可以與FimH(一種細(xì)菌纖維蛋白)結(jié)合的受體GP2以及其它的重組蛋白,如重新分布的黏附蛋白beta 1整合素,免疫球蛋白A結(jié)合蛋白等［7］。雖然M細(xì)胞表面還表達(dá)了其他受體,但是并有被證實(shí)其為捕獲受體。在配體介導(dǎo)的M細(xì)胞攝取中,因?yàn)樵谔囟ǔ叽绶秶鷥?nèi)的粒子發(fā)生最優(yōu)吸收,所以粒子的大小和配體密度己知是影響因素。

在某些特定條件下,基于物理化學(xué)性質(zhì)的捕獲的效率明顯高于基于配體的俘獲受體的效率［7］。M細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)因暴露的抗原不同而發(fā)生改變,即M細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與被轉(zhuǎn)運(yùn)物的性質(zhì)有關(guān),如體積大小、表面pH值、表面電荷、疏水性、濃度以及是否存在M細(xì)胞特異性受體等。關(guān)于靜電電荷,帶正電荷的粒子與細(xì)胞的親和力更強(qiáng),在M細(xì)胞頂端的薄黏液層的滯留時(shí)間也比帶負(fù)電荷或非電離的粒子更長［13］。

2.2 過程 微皺褶(M)細(xì)胞是黏膜免疫監(jiān)視系統(tǒng)的一部分,參與啟動(dòng)黏膜免疫應(yīng)答這一重要步驟。它可通過吸附、胞飲和吞噬等方式攝取腸腔內(nèi)的抗原性異物,并以囊泡的形式將其捕獲到的微粒呈遞給固有層的腸道相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue,GALT)(包括淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等),繼而,卵泡相關(guān)上皮(Follicle-associated epithelium,FAE)下的subepidome(SED)區(qū)域內(nèi)的未成熟樹突狀細(xì)胞(DCs)捕獲抗原。抗原啟動(dòng)的DCs經(jīng)過成熟,遷移到GALT的T細(xì)胞區(qū),將抗原呈遞到T細(xì)胞,導(dǎo)致抗原特異性B細(xì)胞的激活,并最終由固有層的漿細(xì)胞產(chǎn)生 IgA 抗體［14］。

M細(xì)胞的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是先通過腸腔,然后穿過上皮黏膜屏障和潛在的免疫細(xì)胞的過程,它可分為三個(gè)階段：腸腔內(nèi)抗原首先被吸附于細(xì)胞頂端膜,然后通過內(nèi)吞囊泡被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)腔室,最后從基底膜經(jīng)胞吐作用出胞,進(jìn)行胞外運(yùn)動(dòng)。M細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)層呈口袋形狀,較薄,可以快速完成胞吞－胞吐過程。一個(gè)完整的胞吞胞吐作用序列最少只需10 min左右［4］,所以M細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制是一個(gè)高效、快速的過程。此外,有最新的研究在對(duì)M細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)M細(xì)胞大量表達(dá)細(xì)胞內(nèi)分子,這些分子可能在通過細(xì)胞外通道［15］的過程中促進(jìn)囊泡運(yùn)輸或肌動(dòng)蛋白重塑,對(duì)于它們的功能分析為M細(xì)胞特異性抗原轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制開辟了新的研究方向［11］。

2.3 M細(xì)胞與凝集素 在M細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)抗原的過程中,靶向作用于M細(xì)胞表面的特定受體,可能有助于增加抗原的吸收和呈遞,從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。凝集素不止有一個(gè)能夠同糖結(jié)合的位點(diǎn),因此其能夠參與細(xì)胞的識(shí)別和粘著,將不同的細(xì)胞聯(lián)系起來。

荊豆凝集素1(Ulex Europaeus Aggulutin-1,UEA-1)可以被綁定到M細(xì)胞上,并作為M細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。但是由于凝集素是有毒的并且容易發(fā)生腸道降解,除此之外,其受體在人PP中未表達(dá),甚至在所有小鼠的M細(xì)胞中也未表達(dá),因此在疫苗接種中UEA-1的價(jià)值是有限的,但是穩(wěn)定的無毒小分子凝集素可能具有口服疫苗靶向的潛力。在誘導(dǎo)抗原特異性黏膜SIgA反應(yīng)中,使用UEA-1對(duì)M細(xì)胞的靶抗原進(jìn)行識(shí)別是有效的,這一點(diǎn)已被證實(shí)。

除UEA-1外,最近還有研究發(fā)現(xiàn),唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)中的成員siglecl-f也是一種新型的腸道M細(xì)胞標(biāo)志物,它表達(dá)于暴露在腸腔的M細(xì)胞膜表面。當(dāng)抗siglecl-f抗體注射到與M細(xì)胞結(jié)合的小鼠小腸中后,顯示出通過siglecl-f靶向 M 細(xì)胞的潛力［16］。

2.4 M細(xì)胞與SIgA M細(xì)胞介導(dǎo)的抗原攝取有助于誘導(dǎo)抗原特異性分泌SIgA,因此M細(xì)胞上的攝取受體可能是有效誘導(dǎo)病原體特異性SIgA的粘膜免疫靶點(diǎn)［10］。M細(xì)胞在黏膜內(nèi)可以通過誘導(dǎo)SIgA的分泌,在不降解內(nèi)化抗原的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而在抗原特異黏膜免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［17］。帶有循環(huán)核苷酸序列(AAAUA)的小鼠GP-2的特殊配體結(jié)合于表達(dá)在細(xì)胞表面的MGP-2是SIgA選擇性捆綁吸收的機(jī)制。Spib-b可誘導(dǎo)GP2,它是有效攝取腔內(nèi)細(xì)菌抗原并將其傳遞到PPs并產(chǎn)生隨后的腸道抗菌免疫反應(yīng)的先決條件［13］。最近有報(bào)道稱,M細(xì)胞表面的Dectin-1結(jié)合SIgA-抗原復(fù)合物,然后此復(fù)合物通過與DCs上的DC-SIGN相互作用被DCs轉(zhuǎn)移并內(nèi)化,從而誘導(dǎo)黏膜和全身免疫應(yīng)答［18］。

3 M細(xì)胞的體外模型

在過去,對(duì)于M細(xì)胞的研究依賴于體內(nèi)或原位培養(yǎng)的方法,如分離的組織環(huán)或外植體培養(yǎng),但在人和大鼠中,M細(xì)胞僅占FAE的5%～10%。如今,為了更好的研究M細(xì)胞,學(xué)者們建立了多種M細(xì)胞的體外模型。其中沿用較廣的是Des Rieux等人建立的模型——體外M細(xì)胞/FAE模型。此模型中,腺癌類腸上皮細(xì)胞系Caco-2通過與PP(peyer patch,PP)或人類淋巴細(xì)胞系共培養(yǎng)分化成M細(xì)胞,模仿其活性。因此,M細(xì)胞體外模型在研究病原體與腸上皮相互作用以及確定跨M細(xì)胞轉(zhuǎn)位所需的分子機(jī)制方面顯示出巨大的潛力。

4 M細(xì)胞與疾病

4.1 克羅恩氏病 克羅恩氏病(CD)是胃腸道炎癥性疾病,好發(fā)于末端回腸和右半結(jié)腸。本病臨床表現(xiàn)有腹痛、腹瀉、腸梗阻,伴有發(fā)熱、營養(yǎng)障礙等。病程多遷延,反復(fù)發(fā)作,不易根治。CD的微小黏膜病變稱為aphtoid病變,aphtoid病變起始于含有M細(xì)胞的FAE。發(fā)生在FAE中的腔內(nèi)抗原/微生物、上皮細(xì)胞和DCs之間的相互作用可能是引起CD的關(guān)鍵步驟。多年來,腸道通透性的增加被認(rèn)為是CD的致病因素。而最近的研究表明,CD中的腸道屏障缺陷是依賴TNF-a的［2］。在炎癥性腸病(IBD)的結(jié)腸炎癥標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)CD結(jié)腸黏膜中DCs數(shù)量增加以及在CD相關(guān)黏膜炎癥淋巴組織中M-DC8(+)DCs和th1型T細(xì)胞的表達(dá),都可能有助于CD中TNF-a的產(chǎn)生。此外,Rickert發(fā)現(xiàn)70%的乳糜瀉患者存在aphtoid病變［2］,而乳糜瀉中常見的屏障功能障礙可能與FAE中免疫抗原相互作用引發(fā)的信號(hào)有關(guān)［19－20］。

4.2 食源性肉毒中毒 肉毒毒素是一種由肉毒桿菌產(chǎn)生的金屬蛋白酶毒素,進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后,它將抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放并導(dǎo)致麻痹。肉毒毒素與一種或多種無毒成分一起組成祖毒素復(fù)合物(progenitor toxin complexes,PTCs),L-PTC與HA和GP2相互作用,突破了M細(xì)胞的腸上皮屏障,最終導(dǎo)致食源性肉毒中毒的發(fā)生。與腸腔環(huán)境中的肉毒毒素有關(guān)的nap(NTNHA/HA的復(fù)合體)在穿過腸上皮細(xì)胞后會(huì)分離,L-PTC的所有成分都通過M細(xì)胞傳遞到基底外側(cè)表面,并被CD11c DCs捕獲。HA與GP2的交互以及L-PTC與M細(xì)胞的定位都需要對(duì)所有HA亞組分進(jìn)行集成即依賴于完整的HA復(fù)合體。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型的抗毒素療法和口腔生物制劑系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)［6］。

4.3 白色念珠菌感染 白色念珠菌粘附在上皮細(xì)胞上隨后發(fā)生內(nèi)化,這是淺表性和侵襲性念珠菌病致病過程中的的一個(gè)關(guān)鍵步驟。這一內(nèi)化過程是由M細(xì)胞經(jīng)肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制通過識(shí)別菌絲主導(dǎo)的,此后,白色念珠菌侵入共培養(yǎng)物(與Raji B細(xì)胞系的B淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞稱為共培養(yǎng),可獲得M細(xì)胞),并在M細(xì)胞中進(jìn)行有效傳遞。除內(nèi)吞作用外,白色念珠菌也能夠在與M細(xì)胞相互作用的早期階段利用菌毛通過主動(dòng)穿透侵入M細(xì)胞。由此可見,通過M細(xì)胞,白色念珠菌能夠用兩條途徑侵入腸細(xì)胞層［21］。

4.4 人類變異型克雅氏病 人類克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD)是傳染性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathy,TSE),屬于致命的神經(jīng)退行性疾病。研究表明人類變異型克雅氏病(Variant creutzfeldt-jakob disease,vCJD)與瘋牛病(即牛的TSE)有關(guān),vCJD是人類食用了受到瘋牛病病毒污染的食品之后引起的。PrPSc作為瘋牛病的病原體,經(jīng)口腔傳播時(shí),通過腸道上皮細(xì)胞后經(jīng)M細(xì)胞迅速整合入派爾集合淋巴結(jié)的FAE中,表明M細(xì)胞參與了在人體中運(yùn)輸瘋牛病的病原體的過程。此外存在于M細(xì)胞的囊泡中的醛縮酶A作為PrP結(jié)合蛋白可與PrPSc結(jié)合,且M細(xì)胞分化的牛腸上皮細(xì)胞系能夠在我們的體外模型中轉(zhuǎn)染PrPSc。這些都表明了M細(xì)胞在人類變異型克雅氏病的致病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［9］。

4.5 炎癥性腸病 在腸道炎癥方面,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)慢性腸道炎癥產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子可誘生PP型M細(xì)胞［6］。證據(jù)在于腸道炎癥,如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),會(huì)產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子,而目前的研究表明任意表型子集的M細(xì)胞的發(fā)育和功能都與炎性細(xì)胞因子的局部產(chǎn)生密切相關(guān)［6］,例如在研究結(jié)腸炎的右旋糖酐鈉和檸檬酸桿菌模型的過程中,結(jié)腸上皮炎癥最嚴(yán)重時(shí)都能誘導(dǎo)出大量的PP表型M細(xì)胞［6］。若將這一觀點(diǎn)加以有效利用,則被誘生的M細(xì)胞可能在感染或自身免疫失調(diào)方面為結(jié)腸炎癥提供臨床診斷。

5 M細(xì)胞的應(yīng)用與發(fā)展

病原體可以利用M細(xì)胞作為感染入口,同樣,利用M細(xì)胞特異的機(jī)制可以為黏膜免疫系統(tǒng)提供藥物或疫苗,而疫苗接種是M細(xì)胞免疫學(xué)最成功的應(yīng)用之一［4］。

5.1 M細(xì)胞靶向性疫苗 在這里我們介紹三種M細(xì)胞靶向性疫苗。目前制成了一種有效的抗GP2-sa黏膜疫苗,抗GP2-sa可以有效誘導(dǎo)黏膜SIgA反應(yīng),以抗GP2-sa為基礎(chǔ)的M細(xì)胞靶向疫苗是誘導(dǎo)有效黏膜免疫的一種新策略［22］；M細(xì)胞靶向性疫苗CS-FimH-pvP1經(jīng)口服免疫小鼠后,對(duì)柯薩奇病毒誘導(dǎo)的病毒性心肌炎具有保護(hù)作用［4］,這將對(duì)人類病毒性心肌炎治療的研究提供很大幫助；在動(dòng)物模型中由Claudin-4特異性靶向肽介導(dǎo)的M細(xì)胞靶向增強(qiáng)黏膜SIgA反應(yīng)強(qiáng)于對(duì)非靶向黏膜抗原的反應(yīng),這有希望應(yīng)用于黏膜疫苗接種［8］。

5.2 口服疫苗 許多M細(xì)胞靶向分子已被用于黏膜疫苗的開發(fā)［2］,經(jīng)口服的疫苗具有許多優(yōu)勢(shì)：降低傳統(tǒng)注射方式感染病菌的可能性并減少人的疼痛感［4］；使用口服黏膜疫苗建立保護(hù)性免疫可以避免一些最初的病原體感染；能夠促進(jìn)聚集于腸道的M細(xì)胞對(duì)抗原的吸收以建立腸道的局部免疫從而有效抵抗腸道病原體的入侵?，F(xiàn)在口服疫苗已成功應(yīng)用于動(dòng)物,現(xiàn)在研制了一種以M細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞為靶向,傳遞豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)尖刺蛋白核心中和表位(centrotein core neutralization epitope,COE)的抗PEDV感染的口服重組干酪乳桿菌疫苗［23］。因此未來我們可以把開發(fā)針對(duì)M細(xì)胞的口服疫苗作為疾病預(yù)防的重點(diǎn)之一。

6 結(jié)語

綜上所述,M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)抗原是啟動(dòng)黏膜免疫應(yīng)答最重要的第一步。而近年來,隨著對(duì)M細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)抗原的深入研究,M細(xì)胞的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值漸漸顯現(xiàn)出來。M細(xì)胞與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),例如文中已列舉的克羅恩氏病,食源性肉毒中毒和白色念珠菌感染。雖然部分疾病已通過針對(duì)M細(xì)胞的藥物或疫苗得到治療,但目前可用的M細(xì)胞靶向疫苗不主動(dòng)向M細(xì)胞定向抗原,因此就需要我們進(jìn)一步了解M細(xì)胞的機(jī)制以搜索特定的M細(xì)胞分子開發(fā)M細(xì)胞靶向策略,為疫苗的進(jìn)一步研究提供幫助。