劉遠(yuǎn)新，張玉蓉，苗常青

（1.西安體育學(xué)院健康科學(xué)系，陜西 西安 710068；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2.神經(jīng)內(nèi)科，3.急診科，陜西 西安 710061）

血管緊張素Ⅱ2型（angiotensin type 2，AT2）受體活化后對缺血腦卒中動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用[1]。刺激AT2受體可減少小鼠永久性或暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后梗死面積；還可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡并降低小鼠死亡率[2]。最近有研究指出，AT2受體激動(dòng)劑C21可使MCAO大鼠缺血半球神經(jīng)保護(hù)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）表達(dá)增加[3]。但是IL-10增加與大鼠神經(jīng)功能改善的關(guān)系仍不明確。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，通過激活JAK1-STAT3信號(hào)通路發(fā)揮作用[4]。研究已證實(shí)，IL-10在體內(nèi)外具有神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。AT2受體激動(dòng)劑，CGP-42112，不是C21，對葡萄糖剝奪大腦皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用[7]。因而，本研究主要評估AT2受體激動(dòng)劑CGP-42112在MCAO大鼠以及氧糖剝奪（oxygen deprivation，OGD）原代神經(jīng)元模型中的神經(jīng)保護(hù)作用，及其與抗炎細(xì)胞因子IL-10的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠，體重280～340 g，購于西安體育學(xué)院。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為Sham組和MCAO組，MCAO組大鼠進(jìn)一步分為：MCAO組、CGP42112+MCAO組、CGP42112+IL-10中和抗體+MCAO組及IL-10中和抗體+MCAO組，每組各5只大鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 CGP42112、PD123319、TTC染料、MTT和DMSO（美國Sigma公司），TNF-α ELISA試劑盒（廣州銳博生物科技公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），IL-10中和抗體（上海安研商貿(mào)有限公司），剪切Caspase-3抗體（美國Santa公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血再灌模型的復(fù)制 10%水合氯醛麻醉（150～200 mg/kg），然后進(jìn)頸部手術(shù)。顯微鏡下分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。然后用縫合線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用針頭在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈壁上扎1個(gè)小口，將線栓從頸外動(dòng)脈孔插入頸總動(dòng)脈，通過頸內(nèi)動(dòng)脈最后到達(dá)大腦中動(dòng)脈，用縫合線固定線栓，MCAO后3 h拔出線栓，再灌注21 h。模型復(fù)制成功的標(biāo)志是大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)。手術(shù)成功率約為80%。Sham組大鼠僅分離頸部血管，大腦中動(dòng)脈不插入栓線，其他手術(shù)操作步驟同MCAO組。CGP42112（1 mg/kg）和IL-10中和抗體（0.1 mg/kg）均在大鼠再灌時(shí)腹腔注射。

1.2.2 腦梗死體積評估 MCAO手術(shù)后24 h，將大鼠麻醉后取腦，置入-20℃冰箱冷凍15 min后，行冠狀切片，厚度為1.5 mm。將切好的腦片迅速放入準(zhǔn)備 好 的 1% 2，3，5- 三 苯 基 氯 化 四 氮 唑（2，3，5-three，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色（灰白色），而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8]方法計(jì)算MCAO后腦梗死體積。

1.2.3 行為學(xué)評估 Bederson評分：MCAO手術(shù)后24 h，放在空曠的地方進(jìn)行評分。評分范圍在1～3分之間。1分為大鼠提尾懸空時(shí)前肢彎曲；2分為側(cè)推時(shí)阻力降低；3分為向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈。

Beam walk評分測試MCAO手術(shù)后24 h大鼠在橫梁上的平衡。大鼠放在橫梁上1min，評分范圍在0～6分之間。0分：以穩(wěn)定的姿勢在平衡木上；1分：抓住平衡木側(cè)面；2分：抱住平衡木，1肢跌下；3分：抱住平衡木，2肢跌下；4分：40～60 s從平衡木跌下；5分：20～40 s從平衡木跌下；6分：20 s內(nèi)從從平衡木跌下。

1.2.4 ELISA分析 尾靜脈抽取MCAO大鼠血液，通過ELISA試劑盒規(guī)定的步驟檢測血液中TNF-α濃度。1.2.5 原代神經(jīng)元分離和培養(yǎng) 從妊娠Wistar大鼠17 d胚胎中分離大腦皮層。用冷Hank液沖洗，用剪刀剪碎，并用吸管吹打，然后加入胰蛋白酶消化15 min，加入DEME培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液加入新試管中，吸管吹打，靜放10 min，重復(fù)2、3次。用篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，加入DEEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 d后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.6 氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen deprivation/reoxygenation，OGD/R） 為模擬體內(nèi)缺血/再灌注，原代神經(jīng)元進(jìn)行OGD 3、6或9 h后復(fù)氧6 h。對細(xì)胞OGD，把常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基換成無糖培養(yǎng)基，后孵育在缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（94%氮?dú)釴2，5%二氧化碳CO2，小于1%氧氣O2）。復(fù)氧即把無糖培養(yǎng)基換成常規(guī)培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（94%空氣，5% CO2）。在OGD實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)元OGD開始前采用不同濃度CGP42112處理。在OGD/R實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞復(fù)氧時(shí)采用CGP4211（10、100和 1 000 nmol/L）、AT2受體拮抗劑 PD123319（1 μmol/L）或IL-10中和抗體（1 μg/ml）處理。

1.2.7 MTT分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，96孔培養(yǎng)板加入MTT溶液（0.5 mg/ml），反應(yīng)4 h。去除溶液，加入DMSO融解結(jié)晶物，孵育5 min，使用酶標(biāo)儀在540 nm處測量吸光值。

1.2.8 Western blot分析 提取原代神經(jīng)元總蛋白，取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用兔抗剪切Caspase-3多克隆抗體（1∶1 000）和鼠抗β-actin多克隆抗體（1∶2 000）4℃孵育3 h。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。洗膜后用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測并攝片，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one進(jìn)行吸光度積分值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用Tukey HSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10對大鼠體內(nèi)CGP42112介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的影響

經(jīng)方差分析顯示，各組間梗死體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.081，P=0.025），與MCAO組大鼠比較，CGP42112腹腔注射可減少M(fèi)CAO大鼠梗死體積（P=0.032）；而IL-10中和抗體可消除CGP42112誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用（見圖1）。IL-10可能參與CGP42112介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。經(jīng)方差分析也顯示，各組間Bederson（F=12.142，P=0.013）和Beam walk評分（F=9.749，P=0.019）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中CGP42112處理可改善MCAO手術(shù)24 h后 大 鼠Bederson（P=0.017） 和 Beam walk評 分（P=0.026），而IL-10中和抗體可阻止神經(jīng)功能恢復(fù)（見圖2）。各組間血液TNF-α濃度差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.537，P=0.006），與Sham組大鼠比較，MCAO組大鼠血液中炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平增加。而CGP42112腹腔注射可降低MCAO大鼠血液中TNF-α濃度（P=0.012），IL-10中和抗體也可消除CGP42112的抗炎作用（見圖3）。

2.2 CGP42112在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮直接神經(jīng)保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，原代神經(jīng)元OGD 6 h，然后復(fù)氧6 h提供最合適的細(xì)胞死亡數(shù)量。MTT分析顯示各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.537，P=0.018）；與Sham組比較，不同濃度CGP42112（10、100和1 000 nmol/L）處理均可使OGD/R神經(jīng)元活力增加（P=0.013、0.009及 0.008）（見圖 4）。Western blot顯示不同組細(xì)胞剪切Caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.058，P=0.027），其中CGP42112具有抗凋亡作用，CGP42112抗凋亡作用可被AT2受體拮抗劑PD123319抑制，但是IL-10中和抗體對該效應(yīng)無影響（見圖5）。結(jié)果表明，CGP42112在體外發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且與IL-10無關(guān)。

圖1 典型TTC染色腦片及定量不同組間梗死體積

圖2 各組MCAO手術(shù)24 h行為學(xué)評分

圖3 各組大鼠血液TNF-α濃度 （ELISA）

圖4 各組細(xì)胞的活力 （MTT）

圖5 各組細(xì)胞剪切Caspase-3表達(dá) （Western blot）

3 討論

近年研究已證實(shí)，炎癥反應(yīng)在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有許多組織和細(xì)胞可產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，比如IL-10和TNF-Α等[9]。該細(xì)胞因子在腦缺血/再灌注引起的炎癥損傷過程中廣泛參與，在神經(jīng)元損傷及修復(fù)過程中也發(fā)揮重要作用。AT2受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究已經(jīng)證實(shí)，AT2受體可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和再生，從而具有神經(jīng)保護(hù)功能[10]，但是其確切作用機(jī)制仍不明確。該研究證實(shí)，AT2受體激動(dòng)劑CGP42112可能通過IL-10在大鼠暫時(shí)性MCAO后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用。此外，目前結(jié)果也顯示，CGP42112在原代神經(jīng)元OGD/R損傷中直接發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，與IL-10調(diào)節(jié)無關(guān)。

最近有報(bào)道指出，AT2受體激動(dòng)劑在腎臟炎癥和心肌缺血模型通過刺激活A(yù)T2受體發(fā)揮保護(hù)作用，而且IL-10也在其中發(fā)揮作用[11]。黃焱平等人研究發(fā)現(xiàn)，CGP42112+缺血/再灌模型組腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)小于Sham組，而IL-4和IL-10表達(dá)高于Sham組；PD123319+缺血/再灌模型組腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)高于Sham組，同時(shí)IL-4和IL-10表達(dá)低于Sham組[12]。在本研究主要明確是否IL-10上調(diào)與CGP42112的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。研究結(jié)果顯示，IL-10中和抗體可消除CGP42112在腦缺血/再灌大鼠中介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用。另外，其他試劑也可通過介導(dǎo)IL-10上調(diào)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。例如，內(nèi)源性肽，黑皮膚素已被證明通過誘導(dǎo)IL-10上調(diào)從而減輕腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷后的組織損傷[13]。CGP42112可以刺激不同細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。CGP42112很難通過完整血腦屏障滲透到大腦中。然而，短暫性MCAO可破壞血腦屏障的完整性[14]。因此，CGP42112可以滲透到缺血腦組織，并刺激未損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生IL-10。

CGP421121也可能通過全身免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。IL-10可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞參與全身免疫細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。在本研究中，阻斷IL-10不能完全逆轉(zhuǎn)MCAO 24 h后大鼠的神經(jīng)功能改善，提示其他介質(zhì)也可能參與CGP421121介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)。

既往研究顯示，AT2受體激動(dòng)劑在體外無神經(jīng)保護(hù)作用[7]。但是本研究中，CGP42112對OGD/R原代神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)為神經(jīng)元存活率增加和細(xì)胞凋亡減少。差異可能是由于體外缺血/再灌模型不一樣所致。LEE在研究中僅僅采用葡萄糖剝奪，而該研究使用氧糖剝奪并聯(lián)合復(fù)氧。但是CGP42112直接神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚待闡明。最近報(bào)告指出，AT2受體在神經(jīng)元線粒體上表達(dá)。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)神經(jīng)元AT2受體表達(dá)增加，從而降低線粒體呼吸[16]。上述結(jié)果提示，AT2受體可能通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

總之，研究結(jié)果表明，IL-10參與AT2受體激動(dòng)劑CGP42112介導(dǎo)的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)作用。此外，CGP42112C21對體外原代神經(jīng)元具有直接的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1]MIN L J, MOGI M, TSUKUDA K, et al. Direct stimulation of angiotensin II type 2 receptor initiated after stroke ameliorates ischemic brain damage[J]. American Journal of Hypertension,2014, 27(8): 1036-1044.

[2]SCHWENGEL K, NAMSOLLECK P, LUCHT K, et al. Angiotensin AT2-receptor stimulation improves survival and neurological outcome after experimental stroke in mice[J]. Journal of Molecular Medicine, 2016, 94(8): 957-966.

[3]ALHUSBAN A, FOUDA A Y, PILLAI B, et al. Compound 21 is pro-angiogenic in the brain and results in sustained recovery after ischemic stroke[J]. Journal of Hypertension, 2015, 33(1): 170-180.

[4]SABAT R, GRüTZ G, WARSZAWSKA K, et al. Biology of interleukin-10[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2010,21(5): 331-344.

[5]王曉霞，楊巧蓮，黨連生. 血清IL-10與缺血性腦卒中早期進(jìn)展的關(guān)系 [J]. 中國老年學(xué) ，2011，31(18): 3484-3486.

[6]SHARMA S, YANG B, XI X, et al. IL-10 directly protects cortical neurons by activating PI-3 kinase and STAT-3 pathways[J]. Brain Research, 2011, 1373(3): 189-194.

[7]SEYOUNG L, BRAIT V H, ARUMUGAM T V, et al.Neuroprotective effect of an angiotensin receptor type 2 agonist following cerebral ischemia in vitro and in vivo[J]. Experimental& Translational Stroke Medicine, 2012, 4(1): 16.

[8]江君，楊巍巍，張楠，等. 低氧預(yù)適應(yīng)減輕腦中動(dòng)脈阻塞所致小鼠缺血性腦損傷[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29(2): 113-118.

[9]方曉艷，孫建寧，苗明三. 不同腦缺血預(yù)處理時(shí)相對再次缺血損傷大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10含量的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(8): 537-540.

[10]REINECKE K, LUCIUS R, REINECKE A, et al. Angiotensin II accelerates functional recovery in the rat sciatic nerve in vivo: role of the AT2 receptor and the transcription factor NF-kappaB[J].Faseb Journal, 2003, 17(14): 2094.

[11]DHANDE I, ALI Q, HUSSAIN T. Proximal tubule angiotensin AT2 receptors mediate an anti-inflammatory response via interleukin-10: role in renoprotection in obese rats[J].Hypertension, 2013, 61(6): 1218-1226.

[12]黃焱平，宋先兵. 血管緊張素Ⅱ2型受體對大鼠腦缺血-再灌注的保護(hù)作用研究[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015(18): 2653-2656.

[13]SPACCAPELO L, GALANTUCCI M, NERI L, et al. Upregulation of the canonical Wnt-3A and Sonic hedgehog signaling underlies melanocortin-induced neurogenesis after cerebral ischemia[J]. European Journal of Pharmacology, 2013, 707(1-3):78-86.

[14]KOZAK W, KOZAK A, JOHNSON M H, et al. Vascular protection with candesartan after experimental acute stroke in hypertensive rats: a dose[J]. Journal of Pharmacology &Experimental Therapeutics, 2008, 326(3): 773-782.

[15]BODHANKAR S, CHEN Y, VANDENBARK A A, et al.Treatment of experimental stroke with IL-10-producing B-cells reduces infarct size and peripheral and CNS in fl ammation in wildtype B-cell-sufficient mice[J]. Metabolic Brain Disease, 2014,29(1): 59-73.

[16]VALENZUELA R, COSTABESADA M A, IGLESIASGON ZALEZ J, et al. Mitochondrial angiotensin receptors in dopaminergic neurons. Role in cell protection and aging-related vulnerability to neurodegeneration[J]. Cell Death & Disease,2016, 7(10): e2427.