袁國輝　戴超　吳兆平

摘 要：目的 探討CyclinA2啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與肝細胞肝癌發(fā)病風險的關系。方法 選取2012年10月～2017年9月在九江市第一人民醫(yī)院確診的原發(fā)性肝細胞肝癌患者180例，同時選擇行體檢的健康志愿者180例作為對照組。分別采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對cyclinA2基因的rs769236位點進行多態(tài)性檢測，比較不同基因型與原發(fā)性肝細胞癌發(fā)病風險的關系。結(jié)果 rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細胞癌的風險顯著高于rs769236GG野生基因型的個體（校正OR=1.825，95%CI=1.133-2.940）。結(jié)論 CyclinA2基因rs769236（G/A）位點A變異可能會增加原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病風險。

關鍵詞：肝細胞肝癌；CyclinA2；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號：R735.7 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.021

文章編號：1006-1959（2018）22-0077-04

Relationship between Polymorphism of CyclinA2 Gene and Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma

YUAN Guo-hui，DAI Chao，WU Zhao-ping，CHEN Wei-li，MEI Bao-hua

（Department of Hepatobiliary Surgery，the First People's Hospital of Jiujiang，Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

Abstract：Objective To investigate the relationship between cyclinA2 promoter single nucleotide polymorphism （SNP） and the risk of hepatocellular carcinoma.Methods From October 2012 to September 2017， 180 patients with primary hepatocellular carcinoma diagnosed in the First People's Hospital of Jiujiang city were selected，at the same time， 180 healthy volunteers were selected as control group.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） was used to detect the rs769236 locus of cyclinA2 gene and compare the relationship between different genotypes and the risk of primary hepatocellular carcinoma.Results The risk of rs769236 allele A （GA+AA） carriers with primary hepatocellular carcinoma was significantly higher than that of the rs769236GG wild genotype （corrected OR=1.825， 95% CI=1.133-2.940）. Conclusion CyclinA2 gene rs769236 （G/A） site A mutation may increase the risk of primary hepatocellular carcinoma.

Key words：Hepatocellular carcinoma；CyclinA2；Single nucleotide polymorphism

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年新增患病人數(shù)超過62萬人次，且1年生存率還不足50%[1]，其發(fā)病率及死亡率分別占第5位和第3位[2，3]，我國是肝細胞癌的高發(fā)地區(qū)之一，占全球新發(fā)病例的56%[4]。流行病學研究表明，肝細胞癌主要與HBV、HCV病毒感染、黃曲霉素B1（AFB1）暴露、吸煙、飲酒等致病因素有關[5，6]。近年來，隨著對腫瘤細胞分子生物學研究的不斷深入，人們已經(jīng)逐漸認識到，腫瘤是一類細胞周期性疾病，細胞周期的調(diào)節(jié)紊亂容易導致細胞的增殖失控，增殖和凋亡的平衡一旦被打破，便可能會導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。國內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中存在著細胞周期素A2（cyclinA2）的過表達，并與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系[8，9]。最近國外有研究發(fā)現(xiàn) cyclinA2 基因啟動子區(qū) rs769236位點G/A多態(tài)性與肝細胞癌的易感性有關[10]，到目前為止，尚未見關于 cyclinA2 基因 rs769236位點G/A多態(tài)性與中國人群原發(fā)性肝細胞癌發(fā)病風險的相關性的研究報道。故本文就重點討論 cyclinA2啟動子區(qū) rs769236位點G/A多態(tài)性在中國漢族人群中分布頻率的差異，分析與原發(fā)性肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的關系，并為原發(fā)性肝細胞癌的早期診斷、治療及判斷預后提供新的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年10月～2017年9月在九江市第一人民醫(yī)院就診確診為原發(fā)性肝細胞癌的患者180例設為病例組，診斷符合2001年9月第八屆原發(fā)性肝細胞癌學術會議上通過的原發(fā)性細胞肝癌的診斷標準。選擇同期來我院健康體檢的健康人群180例設為對照組。本研究經(jīng)九江市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核通過。所有患者抽血前均未接受過化療及放療，均未輸過血，采用統(tǒng)一的流行病學調(diào)查問卷，研究對象均簽署知情同意書。研究對象的人口學信息及相關危險因素暴露資料具體標準 吸煙、飲酒史：按WHO標準，一生中連續(xù)或累計吸煙6個月或以上者定義為吸煙者，每周飲酒至少一次，連續(xù)6個月或以上者定義為飲酒者；HBV感染定義：血清感染標志物HBsAg陽性判定為HBV感染；HCV感染定義：血清HCV-RNA及抗HCV均陽性或HCV-RNA單獨陽性即可判定為HBV感染。腫瘤家族史：一級親屬和（或）二級親屬患有癌癥者定義為有癌癥家族史，否則就定義為無。

1.2方法 兩組患者均于清晨采集外周靜脈血2 ml，EDTA-Na抗凝，用于PCR檢測，采用PCR-RFLP技術檢測Cyclin A2基因型。

1.2.1 DNA提取 采用DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術公司），提取每份抗凝外周血的總DNA，操作均按說明書進行，將提取好的DNA溶解于pH8.0 TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 PCR（PCR試劑購自TAKARA公司）擴增含有rs769236（G/A）位點的片段：上游引物5'-CGCTCACTAGGTGGCTCAG-3'和下游5'-CCGAGGAGGTTGCGAAAGG-3'（南京金斯瑞生物科技有限公司合成）。PCR反應在20 μl體系中進行， PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物凝膠回收 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收，操作均按瓊脂糖凝膠回收試劑盒（promega公司）說明書進行操作。

1.2.4酶切反應 建立20 μl酶切反應體系，其中雙蒸水10 μl，緩沖液2 μl，PCR回收產(chǎn)物7 μl，Bgl Ⅰ內(nèi)切酶（Fermentas公司）1 ul，37 ℃恒溫2 h，酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR擴增片段為342bp， GG基因型能被Bgl Ⅰ內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生兩個片段（259bp、83bp），AA基因型只產(chǎn)生1個片段（342bp），雜合子GA基因型則產(chǎn)生3個片段（342bp、259bp和83bp），見圖1。

1.3統(tǒng)計學分析 應用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用？字2檢驗比較原發(fā)性肝細胞癌組和對照組的人口學數(shù)據(jù)、基因型以及等位基因頻數(shù)分布。以擬合優(yōu)度？字2檢驗計算 SNP位點各基因型在對照組中的分布是否符合哈迪一溫伯格遺傳平衡定律（HWE）。以單因素和多因素logistic回歸計算比值比（ORs）及其95%可信區(qū)限（CI），分析各基因型與肝癌發(fā)生易感性的關系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.001表示統(tǒng)計學意義顯著。

2結(jié)果

2.1兩組一般情況比較 兩組研究對象年齡、性別、HCV感染分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；吸煙史、飲酒史、HBV感染比較，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.001），腫瘤家族史比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 CyclinA2基因多態(tài)性與原發(fā)性肝細胞癌易感性的關系 對照組中cyclinA2 基因rs769236位點（G/A）各基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（？字2=0.446， P=0.504）。Logistic回歸分析，rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細胞癌的風險顯著高于rs769236GG野生基因型的個體（校正OR=1.825，95%CI=1.133～2.940），見表2。

3討論

細胞周期素、細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）和細胞周期素依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI） 共同調(diào)控著細胞周期的順利進行[10，11]。Wang J等[12]于1990年首次在原發(fā)性肝細胞癌HBV DNA整合部位上檢測到CyclinA2基因它定位于人類染色體4q27上，由432個氨基酸組成的，于G1晚期開始合成，其含量在S期逐漸增加，并于G2/M期達到高峰，在M中后期降解。CyclinA2作為細胞周期的正性調(diào)控因子，在細胞周期進程中起重要作用，可分別與CDK2、CDK1相結(jié)合，以復合物的形式作用于G1/S期和G2/M期2個檢查點的轉(zhuǎn)換，而且具有調(diào)節(jié)DNA合成和促進細胞有絲分裂的雙重作用[13-15]。

有研究研究證明，CyclinA2不僅在原發(fā)性肝細胞癌中存在高表達[8，9]，在非小細胞肺癌[10]、乳腺癌[16]、胃癌[17]、大腸癌[10，18]等多種腫瘤中也存在高表達，并與這些腫瘤的預后及早期復發(fā)的診斷關系密切。近期研究也表明，抑制CyclinA2的表達可以有效阻止肝癌細胞的增殖[19]，從而有效控制腫瘤的進一步發(fā)生及發(fā)展[20]。CyclinA2可通過Akt/FOXO3a/IQGAP/mTOR等信號通路促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[21-23]，但具體機制及其他相關機制目前還需進一步研究。

單核苷酸多態(tài)（SNP）是人類遺傳變異最常見的類型，位于啟動子區(qū)域的SNP通常對疾病的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[24，25]。本研究提供了CyclinA2 基因啟動子區(qū)多態(tài)性與中國漢族人群原發(fā)性肝細胞癌發(fā)病風險相關聯(lián)的新信息，本研究發(fā)現(xiàn)rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細胞癌的風險高于rs769236GG野生基因型的個體（校正OR=1.825，95%CI =1.133 -2.940）；通過進一步的分層分析，發(fā)現(xiàn)在無腫瘤家族史者中攜帶rs769236等位基因A者與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病風險有顯著關聯(lián)，這說明rs769236位點A變異可能是一個致病因素。我們推測，當CyclinA2基因啟動區(qū)的rs769236位點發(fā)生A變異后，使得其基因啟動子的活性增加，cyclinA2基因轉(zhuǎn)錄活性增強，從而使得其蛋白表達升高。張益等[19]研究認為，CyclinA2蛋白的表達失控主要是由于其基因的轉(zhuǎn)錄活性增強，也有一部分可能與蛋白質(zhì)翻譯以及翻譯后調(diào)節(jié)失控或蛋白質(zhì)降解減少有關。當CyclinA2過表達時，可在整個細胞周期持續(xù)性激活CDK2磷酸化的底物，并直接或間接地釋放過量的轉(zhuǎn)錄因子（如E2F等），促進G1/S期轉(zhuǎn)換和DNA合成，如超越了細胞周期的調(diào)控機制便會導致細胞的異常增殖，并最終癌變。CyclinA2基因啟動子區(qū)多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)改變了我們對基因表達的認識，盡管我們在這一領域的認識不斷進步但還有大量問題需要解決，如CyclinA2基因啟動子區(qū)多態(tài)性是否與原發(fā)性肝細胞癌的進展、侵襲力、轉(zhuǎn)移情況、預后等有相關性，至今國內(nèi)外尚未見報道。

本研究中還發(fā)現(xiàn)肝癌組和對照組比較在年齡、性別、HCV感染分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與既往相關文獻報道結(jié)果不一致，考慮其原因可能與本實驗入組樣本存在種族差異、地域差異有關，也可能與本實驗樣本量小存在一定的抽樣誤差有關，在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)擴大樣本量并在不同族群、多個地域間抽樣，進一步探討CyclinA2基因啟動子區(qū)多態(tài)性引發(fā)原發(fā)性肝細胞癌的具體分子機制，并為肝癌的早期診斷、治療及判斷預后提供新的理論依據(jù)。

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收稿日期：2018-7-17；修回日期：2018-8-15

編輯/肖婷婷