李嘉懿 郭 茜 張紅星 謝遠紅 劉 慧* 連正興

(1.北京農學院食品科學與工程學院，微生態(tài)制劑關鍵技術開發(fā)北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 102206；2.中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

脂肪肝綜合征(fatty liver syndrome，FLS)是由于肝臟內脂肪異常堆積代謝紊亂引起的一種代謝性疾病，常見于產蛋高峰期和后期蛋雞[1-3]。Couch于1954年首次在美國西南部的產蛋雞上首次發(fā)現FLS。FLS主要發(fā)生于籠養(yǎng)產蛋雞，會導致產蛋雞產蛋率明顯下降，死亡率升高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經濟損失。生產實踐中發(fā)現，多數由于FLS死亡的母雞，主要原因是肝臟脂肪積累過多，肝臟破裂導致出血和死亡。多數母雞產蛋后或產蛋率達不到高峰時才被發(fā)現患有FLS，因此飼養(yǎng)過程中可以微生態(tài)制劑預防為主，以提高母雞的抗氧化能力。徐鵬研究發(fā)現，地衣芽孢桿菌TS-01可以預防產蛋雞FLS的發(fā)生；Pan等研究發(fā)現，飼糧中添加益生菌可以增加產蛋雞血清谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性。目前有關凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)對北京產蛋油雞FLS的預防及其抗脂質過氧化能力的研究尚未見國內外報道。因此，本文以北京油雞為試驗對象，通過在基礎飼糧中添加凍干菌粉形式的凝結芽孢桿菌Liu-g1，研究其對產蛋雞脂質過氧化特征指標丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和抗脂質過氧化特征指標及血清甘油三酯(triglycerides,TG)含量的影響，并通過觀察肝臟組織切片油紅O染色和測定肝臟粗脂肪含量，研究凝結芽孢桿菌Liu-g1對FLS的預防作用和抗氧化活性，旨在為開發(fā)具有抗氧化能力的凝結芽孢桿菌Liu-g1微生態(tài)制劑提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

凝結芽孢桿菌Liu-g1，篩選于傳統干酪，經本課題組前期試驗研究鑒定為產中性蛋白酶的菌株。

1.1.2 微生態(tài)制劑

于優(yōu)化發(fā)酵條件下對凝結芽孢桿菌Liu-g1進行發(fā)酵，經離心濃縮和真空冷凍干燥，得到活菌數為7.35×1010CFU/g的凍干菌粉活菌制劑微生態(tài)制劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粕1.0%、玉米淀粉4.0%、碳酸鈣0.6%。

平板計數瓊脂(PCA)培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂17.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 儀器與設備

BT2202S電子天平(Electronic Balance，Sartorius公司，德國)、真空冷凍干燥機(Vacuum Freeze Dryer，Labconco公司，美國)、TGL-20M型高速臺式冷凍離心機(High Speed Refrigerated Centrifuge，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)、202-001電熱恒溫干燥箱(Electrothermal Constant-Temperature Dry Box，北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 試驗設計與飼糧

選擇120只體重差異不顯著(P>0.05)、健康的14周齡北京油雞產蛋雞，隨機分為空白對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組4個組，每組3個重復，每個重復10只?？瞻讓φ战M飼喂基礎飼糧，試驗組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)分別飼喂在基礎飼糧中添加10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1的試驗飼糧，使各試驗組攝入活菌數量分別為108、109、1010CFU/kg。基礎飼糧配制參考NRC(1994)標準，其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。凝結芽孢桿菌Liu-g1微生態(tài)制劑由本實驗室自制。試驗用北京油雞由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供，采用3層階梯式籠養(yǎng)雞舍，光照時間16 h，飼養(yǎng)溫度20～23 ℃，人工喂料撿蛋，自由采食和采水，并按常規(guī)程序免疫。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 9 500 IU，VB11.5 mg，VB29.0 mg，VB63.0 mg，VB120.02 mg，VD32 375 IU，VE 19 IU，VK31.40 mg，生物素 biotin 0.95 mg，葉酸 folic acid 0.93 mg，D-泛酸鈣D-pantothenic acid 9.3 mg，Cu (as copper sulfate) 15 mg，Fe (as ferrous sulfate) 60 mg，Mn (as manganese sulfate) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 70 mg，I (as potassium iodide) 0.50 mg，Se (as sodium selenite) 0.59 mg。

2)營養(yǎng)水平均為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集

血清采集：試驗第10周，每組按重復取10只雞用無菌注射器翅下靜脈采血，每只采血2～3 mL，37 ℃凝血約2 h之后取出血清于2 mL離心管中，于4 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

肝臟組織：試驗第10周，每組按重復隨機宰殺5只油雞，摘取肝臟并剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的肝臟分組浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定備用。

1.3.2 測定方法及指標

1.3.2.1 肝臟組織顯微鏡觀察

肝臟組織油紅O染色切片，顯微鏡下觀察。

1.3.2.2 肝臟組織粗脂肪含量測定

取各組新鮮肝臟，分別冷凍干燥48 h，經過40目篩，稱取2.00～5.00 g，全部移入濾紙筒內，依據GB/T 5009.6—003《食品中脂肪的測定》的方法[10]測定肝臟粗脂肪含量。

1.3.2.3 血清抗氧化指標測定

取1.3.1步驟冷凍的血清樣品，送至北京中同藍博臨床檢驗所有限公司測定甘油三酯含量、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、GSH-Px活性、MDA含量。

1.4 數據統計分析

試驗數據用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan氏法多重比較檢驗。試驗數據用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清甘油三酯含量的影響

由圖1可見，與空白對照組相比，10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組的血清甘油三酯含量均顯著下降(P<0.05)，分別降低了18.91%、57.55%、56.05%。100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組血清甘油三酯含量顯著低于10 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組(P<0.05)，且100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組血清甘油三酯含量最低。

2.2 肝臟組織油紅O染色切片

經油紅O染色后，肝臟細胞內脂肪滴呈紅色，細胞核呈藍色。由圖2可見，空白對照組肝臟切片明顯有大量的紅色脂肪滴，而試驗組肝臟組織切片中紅色脂肪滴數量均明顯少于空白對照組，100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組幾乎沒有。這說明飼糧添加100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組效果最好。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖3同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01). The same as Fig.3.

圖1凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清甘油三酯含量的影響

Fig.1 Effects ofBacilluscoagulansLiu-g1 on serum triglyceride content of laying hens (n=10)

2.3 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞肝臟粗脂肪含量的影響

由圖3可見，與空白對照組相比，10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組蛋雞肝臟粗脂肪含量均極顯著降低(P<0.01)，分別降低了56.45%、70.91%、66.78%。100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組肝臟粗脂肪含量極顯著低于10 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組(P<0.01)，降低了33.20%。這進一步驗證了未飼喂凝結芽孢桿菌Liu-g1時肝臟可能有脂肪堆積現象，而試驗組結果表明凝結芽孢桿菌Liu-g1可以顯著改善這一現象，具有較強抑制脂肪肝的作用。其中，100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組效果最好。該結果與圖2中肝臟組織油紅O染色切片結果一致。

A：空白對照組；B：10 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組；C：100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組；D：1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組。

A: blank control group; B: 10 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group; C: 100 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group; D: 1 000 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group.

圖2肝臟組織油紅O染色切片

Fig.2 Liver tissue sections with oil red O staining (400×)

圖3 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞肝臟粗脂肪含量的影響

2.4 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清抗氧化指標的影響

由表2可知，與空白對照組相比，10、100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組的血清T-AOC分別顯著提高了19.81%、29.62%(P<0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組的血清GSH-Px活性分別顯著提高了39.15%、48.15%、40.21%(P<0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組血清SOD活性均有一定程度的提高(P>0.05)，分別提高了1.38%、6.64%、10.45%；10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組的血清MDA含量均有一定程度的降低(P>0.05)，分別降低了13.58%、20.79%、19.64%。這說明凝結芽孢桿菌Liu-g1具有較好的脂質抗氧化能力。其中，100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組效果最佳。

3 討 論

3.1 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清甘油三酯和肝臟粗脂肪含量的影響

甘油三酯是脂肪酸和甘油合成的脂肪分子[11]。血液中高水平的甘油三酯與動脈粥樣硬化和心臟病有關[12-15]，同時也是引發(fā)脂肪肝的可能原因。蛋雞脂肪合成主要在肝臟中進行[16]。研究表明，肝臟脂質合成和分泌之間的平衡是調節(jié)蛋雞肝臟內脂肪沉積的關鍵[17]。產蛋前期，肝臟大量合成脂肪以滿足蛋黃沉積脂質的需要，當合成脂肪的速度大于向外轉運的速度時，過量的脂肪就會沉積到肝臟中，最后導致肝臟脂質代謝紊亂，嚴重者導致肝內出血而死亡[11]。若血清甘油三酯含量高，可導致肝臟攝入的游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)過多，促使肝臟合成甘油三酯過多，進而可能導致肝臟脂質代謝紊亂和脂肪肝的形成[18]。曹友德等[19]研究了高脂血癥、FFA和脂肪肝的相關性發(fā)現，高甘油三酯組高脂血癥、脂肪肝發(fā)病率和FFA含量均顯著高于正常血脂組，且脂肪肝組甘油三酯、FFA含量顯著高于非脂肪肝組，因此甘油三酯含量高可能導致脂肪肝的形成。本試驗選取北京油雞產蛋雞為研究對象，檢測產蛋雞血清甘油三酯的含量，結果發(fā)現未飼喂凝結芽孢桿菌Liu-g1的空白對照組血清甘油三酯含量偏高，有可能形成脂肪肝；而試驗組血清甘油三酯含量顯著降低，說明該菌有可能抑制脂肪肝形成，但需要進一步通過測定肝臟脂肪含量和血清抗氧化指標，證明凝結芽孢桿菌Liu-g1具有預防脂肪肝的作用和抗氧化活性。由圖2和圖3可知，進一步通過測定肝臟粗脂肪含量和觀察肝臟組織油紅O染色切片，發(fā)現未飼喂凝結芽孢桿菌Liu-g1的空白對照組產蛋雞肝臟組織中粗脂肪含量偏高，且油紅O染色切片脂肪滴數量最多，且隨著飼糧凝結芽孢桿菌Liu-g1添加水平的增加，肝臟組織中粗脂肪含量降低，同時油紅O染色脂肪堆積現象明顯減少。這說明凝結芽孢桿菌Liu-g1能調節(jié)肝臟脂質合成和分泌之間的平衡，顯著改善肝臟脂肪堆積，有效抑制蛋雞脂肪肝的形成。其抑制機理可能與凝結芽孢桿菌Liu-g1具有脂質抗氧化活性有關。

表2 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清抗氧化指標影響

同行數據肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 凝結芽孢桿菌Liu-g1對產蛋雞血清抗氧化指標的影響

Day等[20]提出脂肪肝發(fā)病機制“二次打擊”假說。該假說認為第一次打擊即肝臟脂肪變性，第二次打擊則是由氧化應激引發(fā)的脂質過氧化。研究表明，脂肪肝的形成與體內抗氧化系統損傷及脂質過氧化有關[21]。機體在能量代謝過程中發(fā)生氧化還原反應所產生的電子傳遞過程中，氧不可避免的會發(fā)生不完全還原反應而產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[22]。ROS可能會引發(fā)脂質過氧化，破壞DNA鏈，損傷生物膜和組織等[23]。正常情況下，機體可以通過抗氧化防御系統來保護自身免受ROS帶來的傷害。其中，SOD和GSH-Px是機體抗氧化系統中重要的2種酶。SOD能有效將超氧陰離子轉化為過氧化氫，然后通過GSH-Px降解成水[24-25]?？寡趸到y不能消除的過量ROS會攻擊生物膜的不飽和脂肪酸，并引發(fā)脂質過氧化而產生氧化應激的標志性產物——MDA[26]。T-AOC表示清除機體過剩的ROS而使其在細胞內保持一定水平，其水平高低代表了機體的抗氧化能力[27]。

本試驗研究表明，與空白對照組相比，100 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1組蛋雞血清T-AOC顯著提高，3個試驗組血清GSH-Px活性均顯著提高，血清SOD活性和MDA含量分別有一定程度的提高和降低。宮秀燕等[28]研究發(fā)現，凝結芽孢桿菌顯著提高了肉雞血清T-AOC，極顯著提高了血清SOD活性，顯著降低了血清MDA含量，并且顯著提高了血清GSH-Px活性，這與本試驗結果相似。Kodali等[29-30]從凝結芽孢桿菌RK-02發(fā)酵液中提取到了具有明顯清除自由基和抗氧化活性的胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)；袁建鋒等[31]篩選到1株芽孢桿菌，發(fā)現其產生的EPS具有強抗氧化活性，并且對脂質過氧化有抑制作用；梅秀明等[32]研究表明，乳酸菌EPS能極顯著提高血清SOD活性，極顯著降低血清MDA含量，說明EPS能夠增強機體抗氧化能力；李景艷[33]體外試驗表明，EPS能顯著提高血清T-AOC、SOD活性，顯著降低血清MDA含量，能清除自由基，增強抗氧化能力。本研究凝結芽孢桿菌Liu-g1提高蛋雞脂質抗氧化能力是否由產生的EPS的作用，有待后期試驗研究。

4 結 論

飼糧添加10、100、1 000 mg/kg凝結芽孢桿菌Liu-g1能降低蛋雞血清甘油三酯含量，肝臟粗脂肪含量，并提高血清T-AOC、GSH-Px、SOD活性，降低血清MDA含量；綜合考慮，凝結芽孢桿菌Liu-g1添加水平為100 mg/kg時效果最好。

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