唐志文 蔣林樹 楊 亮 孫福昱 熊本海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.北京農(nóng)學院,奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206)

長久以來，抗生素被作為飼料添加劑用于反芻動物生產(chǎn)，其目的是預防能量代謝疾病，調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵，提高動物生產(chǎn)性能。但隨著生活品質(zhì)的提高，人們越來越關(guān)注抗生素藥物殘留所引起的問題，如致癌、致畸以及致突變等。2006年，歐盟明確禁止在飼料中添加抗生素。因此，尋求抗生素的替代品成為了國內(nèi)外學者越來越關(guān)注的研究方向。傳統(tǒng)中草藥富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和微量元素等，可作為添加劑用于動物生產(chǎn)，而且與其他添加劑相比，傳統(tǒng)中草藥還具有無毒、無耐藥性以及無殘留等特點，可以確保動物產(chǎn)品的安全性。但目前研究的可以作為飼料添加劑用于動物生產(chǎn)的中草藥并不是很多。因此，可以有效調(diào)節(jié)瘤胃微生態(tài)、提高動物生產(chǎn)性能的新型中草藥添加劑備受期待。

金銀花又名忍冬花，是忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunh)的干燥花蕾，它作為一味名貴中草藥，被廣泛用于制藥以及保健食品制作等。金銀花中含有有機酸、黃酮、皂苷、揮發(fā)油及微量元素等成分，其主要活性成分為綠原酸。研究表明，金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗炎、增強免疫力、保肝利膽等作用。目前，金銀花及其提取物已經(jīng)逐漸應用于畜禽生產(chǎn)。有研究顯示，金銀花提取物可以改善肉?？寡趸阅?，緩解肉牛熱應激反應[6-8]。還有研究顯示，金銀花不僅可以改善肉雞生長性能和腸道微生物菌群，而且可以作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，調(diào)整大鼠腸道菌群失調(diào)[10-11]。因此，本試驗通過瘤胃體外發(fā)酵試驗，探究金銀花提取物對奶牛瘤胃微生物發(fā)酵的調(diào)控作用，以期為金銀花提取物作為飼料添加劑應用于動物生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的金銀花提取物選購自陜西中鑫生物技術(shù)有限公司，其中綠原酸含量為10%。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

在北京市誠遠盛隆牛場選取4頭體況良好、體重相近、安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體。奶牛飼喂該場全混合日糧(TMR)(主要成分為玉米青貯、苜蓿、壓片玉米、豆粕、棉籽粕、干酒糟及其可溶物等，精粗比為60∶40)，每天07:00和19:30分2次飼喂，自由飲水，自由采食。

1.3 瘤胃體外發(fā)酵試驗方法

1.3.1 人工唾液鹽配制

人工唾液鹽各組分參照Menke等[12]方法于試驗前1 d配制，組成見表1。各溶液配制好后，按順序依次加入400 mL蒸餾水、100 μL A溶液、200 mL B溶液、200 mL C溶液、1 mL指示劑和40 mL還原液。充分混勻后持續(xù)通入CO2，直至溶液顏色由粉紅變?yōu)闊o色透明，pH調(diào)整至6.80為止。使用前39 ℃預熱。

表1 人工唾液鹽各組分組成

1.3.2 體外發(fā)酵液配制

于晨飼前2.0 h進行瘤胃液采集，4頭瘺管奶牛分別采集500 mL，瘤胃液采集后，用4層紗布過濾，并迅速移入預熱達39 ℃并通CO2的保溫瓶內(nèi)，每頭牛收集適量食糜置于保溫瓶內(nèi)，用于微生物接種，收集完畢后迅速帶回實驗室。在實驗室內(nèi)取4頭牛瘤胃液各250 mL，將食糜用2 L人工唾液鹽沖洗3次，并用4層紗布過濾后與瘤胃液混勻，即完成發(fā)酵液的制備，將發(fā)酵液置于39 ℃水浴鍋中，持續(xù)通入CO2待用。

1.3.3 發(fā)酵底物配制

發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

每千克預混料含有 One kilogram of premix contained the following:VA 250 000 IU，VD 340 000 IU，VE 1 000 IU，Cu 1 g，F(xiàn)e 5 g，Mn 4 g，Zn 5 g，Se 0.01 g，I 0.05 g，Co 0.01 g，Mg 50 g。

1.3.4 試驗設計

瘤胃體外發(fā)酵試驗參照Cherdthong等[13]的方法，將發(fā)酵底物原料配制成TMR形式，65 ℃烘干后粉碎，樣品經(jīng)過1 mm篩過濾。準確稱取約0.2 g培養(yǎng)底于100 mL玻璃注射器中(涂抹凡士林以保證其氣密性)，按照隨機試驗設計，將玻璃注射器分為5組，分別向其中添加金銀花提取物0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/g(底物干物質(zhì)基礎)，每組包含6個重復。在每個玻璃注射器中加入預先混勻并在水浴鍋中加熱達39 ℃的體外發(fā)酵液，將玻璃注射器的空氣排盡，于39 ℃搖床連續(xù)培養(yǎng)24.0 h，試驗共重復3個批次。

1.3.5 發(fā)酵液樣本采集及測定

分別于發(fā)酵1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h記錄產(chǎn)氣量，發(fā)酵24.0 h結(jié)束后將樣品從水浴搖床中取出后置于冰水中，停止培育，然后用便攜式pH計(STARTER-300)立即測定pH。將發(fā)酵液過4層紗布，分裝于4支離心管中，其中3支按發(fā)酵液體積10%添加25%的偏磷酸溶液，混勻后于-20 ℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨態(tài)氮(NH3-N)以及乳酸濃度的測定，余下1支150×g離心15 min，采集上清液用于微生物蛋白(MCP)濃度的測定。

NH3-N濃度利用靛酚比色法[14]測定。主要測定步驟如下：在試管中加入0.05 mL樣品，邊混合邊加入2.5 mL苯酚溶液；加入2.0 mL次氯酸鈉溶液并搖勻；將試管置于95 ℃水浴5 min，60 ℃水浴10 min；取出冷卻后使用天美UV-2600紫外分光光度計于630 nm下比色。

乳酸濃度采用對羥基聯(lián)苯比色法[15]測定。主要測定步驟如下：將發(fā)酵液(或乳酸標準液，制作標曲)4 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL于試管中，加入0.5 mL 20%硫酸銅并混勻；取上述溶液0.5 mL，緩慢加入6 mL預冷的濃硫酸，混勻后置于沸水浴中5 min，取出后迅速置于冰水浴中；加入0.125 mL 1.5%對羥基聯(lián)苯溶液，并迅速搖勻，置于30 ℃水浴中保溫30 min后置于沸水浴90 s，取出置于冰水浴中冷卻至室溫，以蒸餾水為空白使用天美UV-2600紫外分光光度計于565 nm中比色。

VFA濃度以外標法[16]測定。使用Agilent-7890B氣相色譜儀，色譜條件：火焰氫離子檢測器，PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱，柱溫120 ℃，檢測器溫度220 ℃，以氬氣作為載氣，流速30 mL/min，由氫氣發(fā)生器提供氫氣，流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，進樣量2 μL。

MCP濃度利用嘌呤法[17]測定。主要測定步驟如下。

標準曲線的制作：1)分別稱取5、15、25、35、45及55 mg酵母RNA加入10 mL離心管中，加入2 mL 0.6 mol/L HClO4，95 ℃水浴1.0 h，冷卻;2)加入6 mL 28.5 mmol/L的NH4H2PO4，95 ℃水浴15 min，冷卻后在3 000×g，4 ℃條件下離心10 min;3)取1.6 mL上清液，加入6 mL 0.2 mol/L的NH4H2PO4，用85%磷酸調(diào)整溶液pH至2～3；4)取3.8 mL調(diào)整pH后的溶液，加入0.2 mL 0.4 mol/L的AgNO3溶液，混合后于4 ℃避光過夜;5)第2天于3 000×g，4 ℃條件下離心10 min，棄上清液;用5 mL pH為2的蒸餾水沖洗沉淀;再于3 000×g，4 ℃條件下離心10 min，棄上清液;6)向沉淀中加入5 mL 0.5 mol/L的HCl，混勻，95 ℃水浴30 min后，3 000×g離心10 min;7)上清液用0.5 mol/L HCl稀釋40倍后，以0.5 mol/L HCl作參比，在260 nm進行比色(使用天美UV-2600紫外分光光度計)。

發(fā)酵液MCP濃度測定：1)取8 mL發(fā)酵液于10 mL離心管中，在20 000×g，4 ℃條件下離心20 min;棄上清液后加入2.104 mL 0.6 mol/L HClO4，于95 ℃水浴1.0 h后冷卻;2)按照標準曲線制作的步驟2～6操作;3)以0.5 mol/L HCl作參比，在260 nm下比色，根據(jù)吸光度值和標準曲線求出樣品中RNA測定值;4)根據(jù)以下公式計算MCP濃度。

微生物蛋白氮(mg/mL)=[RNA測定值 (mg/mL)×17.83%/10%]×稀釋倍數(shù)；MCP(mg/mL)=微生物蛋白氮(mg/mL)×6.25。

飼糧和發(fā)酵底物干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣、磷含量測定使用實驗室常規(guī)分析方法進行分析[18]，應用Van Soest等[19]的方法測定中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量。泌乳凈能依據(jù)《奶牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 34—2004)計算[20],計算公式如下：

泌乳凈能=0.550 1×消化能(MJ/kg)-0.395 8。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進行初步整理后，采用SAS 9.4中Mixed模型進行進一步分析，并以P<0.05為差異顯著性判斷的標準。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵液pH及乳酸、NH3-N、MCP濃度

由表3可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液pH顯著低于對照組(P<0.05)，發(fā)酵液NH3-N及乳酸濃度均顯著高于對照組，且3個組之間無顯著差異(P>0.05)，0.5 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液pH及乳酸、NH3-N濃度與對照組以及其他3個試驗組均無顯著差異(P>0.05)。試驗組發(fā)酵液MCP濃度均顯著高于對照組(P<0.05)，且2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組顯著高于0.5、1.0 mg/g金銀花提取物組(P<0.05)。

表3 金銀花提取物對發(fā)酵液pH及乳酸、氨態(tài)氮、微生物蛋白濃度的影響

T：處理；L：線性；Q：二次。同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

T： treatment； L： linear； Q： quadric. Values in the same row with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 發(fā)酵液VFA濃度

由表4可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度顯著高于對照組(P<0.05)，0.5 mg/g金銀花提取物組與對照組和其他3個試驗組均無顯著差異(P>0.05)。試驗組的發(fā)酵液乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸濃度以及乙酸/丙酸與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

表4 金銀花提取物對發(fā)酵液VFA濃度的影響

2.3 體外發(fā)酵產(chǎn)氣量動態(tài)變化

由表5可知，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組在1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h的產(chǎn)氣量均顯著高于對照組(P<0.05)，且這3組在1.5、6.0、12.0、24.0 h幾個時間點總產(chǎn)氣量無顯著差異(P>0.05)。0.5 mg/g金銀花提取物組在24.0 h產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)，而1.5、3.0、6.0、12.0 h與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表5 金銀花提取物對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量動態(tài)變化的影響

3 討 論

3.1 金銀花提取物對發(fā)酵液pH及乳酸、NH3-N、MCP濃度的影響

反芻動物瘤胃液pH受眾多因素影響，如唾液分泌量、瘤胃緩沖物質(zhì)以及有機酸生成、吸收和排出速率等[21]。然而體外發(fā)酵系統(tǒng)不受唾液分泌量以及有機酸的吸收、排出速率影響，因此，發(fā)酵液內(nèi)堿性物質(zhì)(如NH3-N)和有機酸的產(chǎn)生成為影響發(fā)酵液pH的主要因素。1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液pH顯著低于對照組，可能是因為這3組乳酸及TVFA濃度高于對照組。楊春佳等[10]給大鼠灌服金銀花提取物發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量均較對照組顯著提高。楊麗梅等在肉雞飲水中添加雙黃連蜂膠口服液，其主要成分為金銀花、黃芩、連翹以及蜂膠，結(jié)果顯示，肉雞腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量較對照組顯著增加。本試驗中，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液乳酸濃度顯著高于對照組，可能就是因為金銀花提取物促進了乳酸產(chǎn)生菌的生長，從而增加乳酸濃度。楊春佳等[10]和楊麗梅等的研究結(jié)果顯示，金銀花及其提取物可以作為益生源調(diào)節(jié)動物腸道微生物菌群，促進有益菌的增殖，抑制有害菌的生長，也就是說金銀花提取物可以促進部分微生物的生長。本試驗中，試驗組發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對照組，可能正是由于金銀花提取物促進了微生物的生長，且促進作用強于抑制作用。NH3-N濃度是瘤胃內(nèi)飼料含氮物質(zhì)降解及微生物對NH3-N利用的綜合反映[22]。本試驗中，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組發(fā)酵液NH3-N濃度顯著高于對照組，而這3組的發(fā)酵液MCP濃度也顯著高于對照組，說明這3組NH3-N濃度的升高不是由于微生物對NH3-N利用程度不夠，而是因為金銀花提取物提高了微生物對發(fā)酵底物含氮物質(zhì)的降解效率。

3.2 金銀花提取物對發(fā)酵液VFA濃度的影響

瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的VFA占反芻動物吸收能量的70%～80%[23]，其中乙酸、丙酸、丁酸等VFA是瘤胃碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，約占TVFA的95%，VFA的主要作用是為動物生產(chǎn)提供能量以及維持瘤胃環(huán)境[24]。本試驗中，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組的發(fā)酵液TVFA濃度顯著高于對照組，說明添加金銀花提取物可以促使微生物發(fā)酵產(chǎn)生更多VFA，這有利于為動物生產(chǎn)提供更多能量，而這3組發(fā)酵液TVFA濃度的顯著提高，可能是因為金銀花提取物促進了部分微生物繁殖，從而產(chǎn)生更多VFA[10-11]。本試驗結(jié)果也顯示，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對照組。

3.3 金銀花提取物對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量動態(tài)變化的影響

產(chǎn)氣量作為體外發(fā)酵體系中評定反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵的重要指標，它綜合性地反映了發(fā)酵底物的可發(fā)酵程度，表明了瘤胃微生物發(fā)酵活動的總體趨勢，是反映發(fā)酵底物可利用性的綜合指標之一[25]。本試驗中，1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組在1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h的產(chǎn)氣量均顯著高于對照組，表明添加金銀花提取物可以提高瘤胃微生物對發(fā)酵底物的利用效率；1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物組發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對照組，說明添加金銀花提取物可以促進瘤胃微生物生長，這可能解釋了為什么添加金銀花提取物可以提高發(fā)酵產(chǎn)氣量。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)條件下，添加1.0、2.0、4.0 mg/g金銀花提取物可以使24.0 h后發(fā)酵液pH及NH3-N濃度顯著降低，并且使發(fā)酵液乳酸、MCP、TVFA濃度以及產(chǎn)氣量顯著增加，綜合經(jīng)濟效益考慮，添加1.0 mg/g金銀花提取物最適宜。

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