劉穎昳，劉金蘭，單瑛琦，王紅梅，吳佳俊，翟新驗*

（1．中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100260；2．北京市房山區(qū)原種豬場，北京 102400；3．北京市大興區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督管理局，北京 100260；4．北京六馬養(yǎng)豬科技有限公司，北京 101300）

豬咀嚼物品時，可通過齒齦和位于口腔黏膜和齒齦組織的毛細(xì)血管滲出豬口腔液，其成分與血清相似，可反應(yīng)出血清中的激素、藥物、抗體和病毒等各種組分[1-3]。目前已有商品化的工具用于豬只口腔液的收集。該采樣方法無創(chuàng)傷、應(yīng)激小、非常適合用于豬群病原及抗體水平的監(jiān)測[4-5]。

利用豬口腔液進行病原和抗體監(jiān)測，目前已經(jīng)有多項報道[1-3]。已報道的豬口腔液可用于監(jiān)測的疫病包括豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）[6-9]、圓環(huán)II型病毒病[10]、甲型流感[11]、非洲豬瘟[12]和口蹄疫[13-14]?？谇灰簷z測可成功檢出病原陽性，與拭子檢測結(jié)果符合率較高。而且，口腔液檢測還可成功檢出抗體變化趨勢，與血清結(jié)果具有較好的符合率。其中，PRRS的檢測技術(shù)最成熟，已經(jīng)有商用PRRS抗體檢測ELISA試劑盒，可得到穩(wěn)定檢測結(jié)果。美國愛德華州立大學(xué)的Jeffrey Zimmerman教授報道了多項關(guān)于豬唾液采樣及其在病原及抗體檢測中的應(yīng)用[6-8]。上述研究表明口腔液采樣作為一種有潛力的監(jiān)測方法，有希望廣泛應(yīng)用于豬場和養(yǎng)殖戶。但是目前的大多數(shù)研究是基于背景清晰的SPF豬的實驗型研究，對于情況更為復(fù)雜的養(yǎng)殖場，其應(yīng)用仍需要進一步數(shù)據(jù)支持。

為了進一步評價該方法在豬場的實際使用效果，我們利用PRRS弱毒活疫苗分別免疫母豬和仔豬，然后分不同時間段進行口腔液和血清采集，然后使用商品化的試劑盒分別測定血液和口腔液中PRRS抗體的消長水平，比較血液和唾液中的抗體消長規(guī)律并分析結(jié)果，進一步完善利用豬口腔液用于PRRS抗體水平評價的方法，以便使該技術(shù)在種豬場進行技術(shù)推廣和使用。

1 材料和方法

1.1 實驗設(shè)計

選取3頭母豬（胎次：5～6胎，大白和長白，一年免疫兩次PRRS活疫苗）用于個體血液和口腔液樣品的采集；同時選取母豬對應(yīng)的3圈仔豬（20 日齡，每圈8～10 頭，未免疫）用于群體血液和口腔液樣品的采集。選取的PRRS活疫苗為高致病性豬繁殖與呼吸道綜合征活疫苗TJMF92株（購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司）。

母豬和仔豬同日免疫PRRS活疫苗，免疫后7 d（1周）、14 d（2周）、21 d（3周）、28天(4周 )、35 d（5周）、42 d（6周）、49 d（7周）后分別采集口腔液；并同時通過耳緣靜脈采血。3頭母豬分別采集血液和口腔液；3圈小豬隨機取3頭采血，每圈共采集1份口腔液。

1.2 口腔液采集

自制未經(jīng)漂白的原色棉繩。母豬用的棉繩直徑為1．5 cm；仔豬用棉繩直徑為0．8 cm。根據(jù)實驗豬舍圍欄高度，將棉繩剪成約80 cm長，使用前，將棉繩在121 ℃下高壓滅菌20 min并烘干。使用前將棉繩末端打散供豬咀嚼，繩子盡量遠(yuǎn)離污物。調(diào)節(jié)高度，保證豬容易咀嚼到。吸引豬群咀嚼15～30 min后，取下棉繩，將濕潤的末端放入大密封袋（8號）用力擠壓?？芍貜?fù)采集，待口腔液收集量達3～5 mL，將其轉(zhuǎn)入離心管中，離心吸取上清。

1.3 試劑盒基本信息

依據(jù)說明書，使用IDEXX PRRS口腔黏液抗體檢測試劑盒和IDEXX PRRS X3抗體檢測試劑盒分別檢測口腔液和血清中的PRRS抗體（采購自北京協(xié)信詩華生物科技有限公司）。結(jié)果計算公式：S/P值=（樣品的OD值—陰性對照值）/（陽性對照值-陰性對照值）；S/P值＞0．40，判為陽性；S/P值≤ 0．40，判為陰性 。

依據(jù)說明書，使用西班牙HIPRA PRRS血液、口腔液二合一抗體檢測試劑盒檢測口腔液和血清中的豬繁殖與呼吸綜合征抗體（采購自北京天之泰生物科技有限公司）。結(jié)果計算公式：IRPC=（樣品的OD值—陰性對照值）/（陽性對照值-陰性對照值）×100。IRPC＞20．0，判為陽性；IRPC≤20．0，判為陰性。

圖1 自制口腔液采樣套裝

圖2 母豬監(jiān)測結(jié)果

圖3 仔豬監(jiān)測結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 口腔液采集效果

對于母豬和仔豬口腔液采樣，在早晨（或者下午，需固定采樣時間）喂食前采集樣品成功率較高，對于單頭母豬，如果首次采樣，母豬不咬繩子的話，將棉繩手動塞入母豬口中直至其咀嚼，訓(xùn)練1～2次后，后續(xù)可順利學(xué)會咀嚼棉繩，母豬樣品量約為3～5 mL。對于仔豬，如果首次采樣，仔豬不咬繩子的話，將繩子用5%蔗糖水浸泡潤濕，訓(xùn)練1～2次后，后續(xù)仔豬可順利學(xué)會咀嚼棉繩，仔豬樣品量約為5～8 mL。離心后上清呈輕微渾濁淺黃色溶液。

2.2 血清與口腔液抗體檢測結(jié)果

母豬血清與口腔液抗體檢測結(jié)果：利用IDEXX檢測試劑盒檢查母豬血清與唾液中的PRRS抗體存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)， PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖2A，圖2C）。而利用HIPRA檢測試劑盒檢測母豬血清與唾液中的PRRS抗體，其中血清中抗體水平一直處在較高的水平（圖2B），但唾液中的PRRS抗體水平在第5周顯著升高（圖2D）。為了進一步表明母豬口腔液抗體水平和血清中抗體水平的關(guān)系，我們對免疫后不同時間的血清和口腔液中PRRS抗體陽性結(jié)果符合率進行了匯總整理，見表1。

仔豬血清與口腔液抗體檢測結(jié)果：利用IDEXX檢測試劑盒檢查仔豬血清與唾液中的PRRS抗體存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)，PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖3A，圖3C）。同時利用HIPRA檢測試劑盒檢查仔豬血清與唾液中的PRRS抗體也存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)，PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖3B，圖3D）。

2.3 血清與口腔液抗體檢測結(jié)果陽性符合率

根據(jù)上述結(jié)果計算血清和口腔液中PRRS抗體陽性率的符合率，符合率=口腔液中PRRS抗體陽性率/血清中PRRS抗體陽性率100%（表1）。對于母豬，免疫后5周后經(jīng)兩種試劑盒檢出符合率為100%；對于仔豬，免疫后4周經(jīng)IDEXX試劑盒檢出符合率為100%，免疫后6周經(jīng)HIPRA試劑盒檢出符合率為100%。

3 討論

豬口腔液中抗體初期主要是IgA和IgM，后期主要為IgG，水平較高且持續(xù)時間可長達數(shù)周。已經(jīng)證實豬口腔液中抗體與血清中抗體水平存在相關(guān)性[3，6，15]?；谶@種相關(guān)性，已經(jīng)開發(fā)出商用口腔液PRRS抗體檢測ELISA試劑盒。為了進一步評價該方法的實際使用效果，我們評估了不同試劑盒對母豬和仔豬口腔液中的PRRS抗體的檢測結(jié)果，并與血清結(jié)果進行了對比。結(jié)果表明在口腔液中，總抗體水平較低。母豬和仔豬中，均是在免疫后第5周在口腔液中檢出抗體水平峰值。此外，之前有研究證實口腔液中PRRS抗體在免疫后5周達到峰值，10周后即迅速降低，而相應(yīng)的血清抗體則可持續(xù)14周仍保持較高水平[8，15，16]，我們的結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。但是在本研究中，由于未持續(xù)跟蹤豬群的抗體水平，對血清和唾液中抗體水平消長規(guī)律無法進行完整描述，例如7周后血清和唾液中免疫抗體變化等，因此無法給出抗體持續(xù)時間。

表1 免疫后不同時間2種試劑盒檢測血清和口腔液中PRRS抗體陽性結(jié)果符合率 %

2個不同品牌試劑盒對血清和口腔液PRRS抗體的檢測結(jié)果存在一定差異。我們發(fā)現(xiàn)IDEXX試劑盒在進行口腔中不同時間段PRRS抗體檢測時，其口腔抗體與血清抗體陽性符合率對于母豬和仔豬分別是免疫后5周和4周達到100%；HIPRA試劑盒對于母豬和仔豬分別是免疫后5周和6周達到100%（表1）。HIPRA試劑盒為口腔液血清二合一試劑盒，可同時檢測口腔液和血清樣品，因此，豬場可根據(jù)實際需求進行選擇。由于口腔液抗體水平較低，根據(jù)我們的結(jié)果，對于所有豬群免疫后6周，使用兩種品牌的試劑盒均可得到較好結(jié)果。

此外，我們觀察到，HIPRA試劑盒檢測母豬血清中PRRS抗體時，從免疫后第1周開始，抗體水平始終處于較高水平，并未檢出上升趨勢（圖2，圖3），可能是由于母豬持續(xù)免疫PRRS弱毒疫苗，血清中IgG抗體水平較高，HIPRA二合一試劑盒用于血清檢測時，針對的是血清中的IgG抗體，因此母豬免疫初期抗體即在較高水平。因此，建議在免疫抗體水平較高的母豬中，使用口腔液進行PRRS抗體檢測，有助于排除本底干擾，可檢測到因免疫新近產(chǎn)生的抗體。

4 小結(jié)

PRRS免疫抗體可通過口腔液進行檢測。免疫后6～7周采集口腔液樣本進行檢測，可進行免疫效果監(jiān)測，結(jié)果與血清結(jié)果符合率較高。同時，不同試劑盒檢測效果有差異，應(yīng)根據(jù)采樣時間和采樣豬群選擇合適試劑盒。

致謝:北京市生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團隊（基金號：BAIC02-2017）

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