李 崢 魏 微

胃癌是臨床常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生因素涉及到基因因素，例如抑癌基因變異。臨床診斷標(biāo)志物在研究胃癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白屬于一類細(xì)胞因子，從IFN干擾素家族刺激誘導(dǎo)分泌出來的蛋白，其在抗增殖、抗腫瘤、抗病毒中具有重要的作用[3-4]。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因和胃癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。本研究目的在于探討IFITM1/2/3和胃癌的發(fā)生、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料

不同的干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白，IFITM1、IFITM2、IFITM3；目的基因質(zhì)粒；真核表達(dá)載體；細(xì)胞株，人體胃腺癌細(xì)胞株(SGC-7901)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 1640培養(yǎng)基，鏈霉素，青霉素，10%胎牛血清，5%山羊血清，引物合成，PCR試劑盒，Western blot顯影液，RNA提取試劑，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.2.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、冷凍高速離心機(jī)、凝膠成像圖像分析儀、凝膠掃描分析儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)、紫外光光柵分光光度計、恒溫?fù)u床。

1.3 檢測方法

1.3.1 細(xì)胞株的培養(yǎng) 在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中加入細(xì)胞株，溫度37 ℃，CO2濃度5%，進(jìn)行孵育，選擇生態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，控制密度為3×105，再把培養(yǎng)板放回溫箱中培養(yǎng)14 h。

1.3.2 RT-PCR檢測IFITM基因 采用RT-PCR 的方法測定組織中IFITM-mRNA水平。取出組織1 g，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。檢測組織中IFITM 基因mRNA 表達(dá)。通過RT-PCR試劑盒合成cDNA，取出2 μg RNA，滅菌，搖均勻，放在65 ℃保溫，5 min后，放在室溫中，靜置10 min，進(jìn)行離心，靜置在平面桌上。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從cDNA序列設(shè)計IFITM基因其引物序列，采用凝膠掃描分析儀測定DNA 電泳條帶和光量子強(qiáng)度，IFITM-mRNA 表達(dá)水平=IFITM/G3PDH。擴(kuò)增引物序列如下：IFITM1：5'-TCTTCTTGAACTGGTGCTGTC-3'；IFITM2：5'-CCTTGACCTGTATTCCACT-3'；IFITM3：5'-TCCCACGTACTCCAACTTCCA-3'。

1.3.3 Wester檢測干擾素誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量 在干擾素誘導(dǎo)蛋白中接入病毒液，48 h后，采用Western 印跡法測定血清抗IFITM的抗體反應(yīng)。在菌體液中加入15 μl的SDS-PAG，電泳分離蛋白質(zhì)，把PAGE膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，溫度4 ℃，時間2.5 h，加入PBS配置5%脫脂奶粉，進(jìn)行封閉，加入TTBS 1∶50 配制患者血清10 ml 作一抗進(jìn)行反應(yīng)，孵育，2 h后，加入TTBS 1∶4 000配制的山羊抗人IgGHRP 10 ml 作二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，可見陽性條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同干擾素誘導(dǎo)蛋白基因的檢測結(jié)果

人體胃腺癌細(xì)胞株(SGC-7901)經(jīng)過干擾素的誘導(dǎo)后，IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因拷貝數(shù)都明顯增加，見表1。可見干擾素誘導(dǎo)促使3種干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的基因水平都得到明顯的升高。由此可見，IFITM1、IFITM2、IFITM3對于胃癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有抑制的作用。

表1 人體胃腺癌細(xì)胞株(SGC-7901)不同干擾素誘導(dǎo)蛋白基因的檢測結(jié)果

2.2 IFITM1、IFITM2、IFITM3相關(guān)性

IFITM1和IFITM2呈顯著正相關(guān)(γ=0.40;P=0.003)，IFITM1和IFITM3呈顯著正相關(guān)(γ=0.45;P=0.001)，IFITM2和IFITM3呈顯著正相關(guān)(γ=0.38;P=0.004)。見圖1。

圖1 IFITM1、IFITM2、IFITM3間的相關(guān)性

3 討論

胃癌屬于臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的死亡率[7]。近年來，我國手術(shù)技術(shù)和外科手術(shù)治療策略不斷改進(jìn)，惡性腫瘤患者的術(shù)后生存率明顯提高，但是其預(yù)后情況并沒有明顯的好轉(zhuǎn)。相關(guān)報道顯示胃癌患者術(shù)后5年生存率低于50%[8]。影響惡性腫瘤患者術(shù)后預(yù)后情況的主要原因在于術(shù)后癌細(xì)胞復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要通過血管和淋巴管發(fā)生惡變[9]。干擾素家族(IFNs)廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療中，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白生物學(xué)功能多樣化，能夠傳導(dǎo)免疫細(xì)胞的信號，在細(xì)胞多種機(jī)制中發(fā)揮著不可替代的作用，例如細(xì)胞粘附、生殖細(xì)胞成熟、癌細(xì)胞生長繁殖、腫瘤發(fā)生等[10]。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因家族包括IFITM1(9-27)、IFITM2(1-8D)、IFITM3(1-8U)，具有高度的同源性，落在染色體11pl5.5位置上，含有干擾素刺激反應(yīng)元件，可使用Ⅰ型和Ⅱ型干擾素進(jìn)行誘導(dǎo)，也就是IFN-a、IFN-B、IFN-y。IFITM能夠調(diào)節(jié)IFN-y的抗增殖能力，其主要的作用途徑為p53，通過該途徑對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制的作用，并且在細(xì)胞生長和免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要的作用。對p53的路徑進(jìn)行干擾或者阻斷能夠減少IFITM1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的生長能力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌、卵巢癌、自身免疫性疾病患者的干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因水平上調(diào)[11-12]，但是關(guān)于干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族在胃癌中的表達(dá)情況研究甚少，IFITM基因在胃癌中的表達(dá)情況及IFITM基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系尚不清楚。

本研究顯示，人體胃腺癌細(xì)胞株(SGC-7901)經(jīng)過干擾素的誘導(dǎo)后，IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因拷貝數(shù)都明顯增加，可見干擾素誘導(dǎo)促使3種干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的基因水平都得到明顯的升高。由此可見，IFITM1、IFITM2、IFITM3對于胃癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有抑制的作用。結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，可見IFITM基因不僅和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，而且還和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。通過降低干擾素誘導(dǎo)蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平能夠有效地抑制癌細(xì)胞的生長和繁殖，并且能夠有效地抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲，從而為胃癌分子靶向治療提供新的方向。同時，表2表明胃癌組3個基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，可見三者相互促進(jìn)表達(dá)，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著協(xié)同作用。

綜上所述，IFITM3基因在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，且降低IFITM的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。但是，目前的研究對于該基因作用于這些腫瘤的侵襲機(jī)制及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚,建議進(jìn)一步研究IFITM基因的作用機(jī)制，為闡明腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開新的方向。

[1] 楊 蓉.卵巢上皮性癌中干擾素介導(dǎo)的跨膜蛋白1的表達(dá)意義〔D〕.第四軍醫(yī)大學(xué),2015.

[2] 胡 俊.IFITM3在胃癌中的表達(dá)及其機(jī)制的研究〔D〕.南京醫(yī)科大學(xué),2015.

[3] 吳榮壽,鄔林泉,李科浩,等.IFITM3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其對MMP-9調(diào)控效應(yīng)〔J〕.中國普通外科雜志,2016,25(1):68-76.

[4] 崔 凱,王 煥,宰守峰,等.干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中華腫瘤雜志,2015,37(5):352-355.

[5] Kudo M.Adjuvant therapy after curative treatment forhepatocellular carcinoma〔J〕.Oncology,2011,81(Suppl 1):50-55.

[6] Li D,Peng Z,Tang H,et al.KLF4-mediated negative regulation of IFITM3 expression plays a critical role in colon cancer pathogenesis〔J〕.Clin Cancer Res,2011,17(11):3558-3568.

[7] 王 偉,王代宏,尹小平,等.胃癌組織IFITM1表達(dá)與臨床及預(yù)后價值的探討〔J〕.臨床外科雜志,2013,21(5):346-349.

[8] 宋哲宇,王大廣,李騰飛,等.家族性胃癌與散發(fā)性胃癌的臨床特點及預(yù)后〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2016,36(2):360-362.

[9] 黃 輝,潘志堅.胃癌干細(xì)胞在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中及血管形成中的作用和機(jī)制〔J〕.中國組織工程研究,2016,20(14):2021-2026.

[10] 蘇占海,楊生璽,王榮華,等.4.1蛋白家族成員merlin與ezrin在青海藏族胃癌中表達(dá)及對胃癌細(xì)胞功能的影響〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,33(1):70-76.

[11] Hickford D,Frankenberg S,Shaw G,et al.Evolution of vertebrate interferon inducible transmembrane proteins〔J〕.BMC Genomics,2012,13(1):155.

[12] 周 勇,鄔林泉.干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3在人類惡性腫瘤中作用的研究進(jìn)展〔J〕.廣東醫(yī)學(xué),2015,36(9):1459-1461.