陳文學(xué) 李金高 程為良 萬(wàn)祥輝 齊淑軼 張宇晴 翁秋敏 李俊玉 熊文敏 謝 琛

鼻咽癌是我國(guó)南方常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，就診時(shí)大部分已是中晚期。鼻咽癌的治療手段主要是放射治療，在患者進(jìn)行根治性放射治療后有40%～60%會(huì)有鼻咽部或(和)頸部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)多見(jiàn)于放射治療后的2～3年內(nèi)。

鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的直接原因。目前鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要檢查方法是影像學(xué)檢查，只有在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤形成一定的體積時(shí)候影像學(xué)才能夠成像，此時(shí)已經(jīng)失去的腫瘤治療的最好機(jī)會(huì)。腫瘤在形成復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之前腫瘤細(xì)胞已經(jīng)在血中播散，外周血中的這種腫瘤細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)[1]。腫瘤的負(fù)荷與血液中的CTC有直接關(guān)系，因此檢測(cè)CTC可以反映腫瘤的狀態(tài)。[2]

本研究采用前期篩選出的適配子結(jié)合微流體裝置捕獲外周血鼻咽癌細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌的無(wú)創(chuàng)診斷。

1 材料與方法

1.1 資料

2016年11月至2017年5月本院收治的鼻咽癌初治患者20例，男性13例，女性7例，中位年齡 43 (32～72)歲。全部患者經(jīng)鼻咽活檢病理證實(shí)為鼻咽癌，病理類型均為低分化鱗癌。所有患者均接受鼻咽、頸部CT掃描，電子鼻咽鏡及胸部正側(cè)位片，腹部B超及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查以明確分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，若患者有骨痛癥狀則行全身骨掃描。臨床分期按92分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。健康體檢者20例，其中男性10例，女性10例，中位年齡32歲。

1.2 微流體芯片的制備

PDMS 微流控芯片制作由蘇州文灝芯片科技有限公司生產(chǎn)。通過(guò)光刻工藝制作SU-8模具，采用PDMS脫模工藝制作PDMS陣列 基片和蓋片，通過(guò)鍵合工藝形成封閉微流體芯片。芯片由進(jìn)樣口、反應(yīng)室、出樣口組成，反應(yīng)室內(nèi)設(shè)置叉排的微繞流柱，微繞流柱為圓形，直徑為45 μm，間距為100 μm。

1.3 微流體芯片的內(nèi)部修飾

通過(guò)兩步法將生物素標(biāo)記的適配子,首先通過(guò)物理吸附將親和素(Invitrogen公司)結(jié)合到微流體芯片的反應(yīng)室內(nèi)壁上，通過(guò)生物素親和素反應(yīng)將標(biāo)記由生物素的適配子固定在反應(yīng)室內(nèi)表面。通過(guò)熒光顯微鏡判斷適配子固定在反應(yīng)室的情況。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞 (C666)、正常人鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)本室保存。無(wú)血清培養(yǎng)基keratinocyte-SFM、1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自 GIBICO 公司。C666細(xì)胞用含有10%熱滅火胎牛血清100IU/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，NP69細(xì)胞用keratinocyte-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有培養(yǎng)的細(xì)胞均用DPBS磷酸緩沖液洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化傳代或收獲細(xì)胞。

1.5 適配子緩沖液

適配子由大連寶生物合成。適配子序列如下FITC-5`-ACCGACCGTGCTGGACTCTACCGCGCAGTGAGGTGAGTGGGGTAGGTTGTTACGTTTCCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3`-Biotin。洗脫緩沖液： 4.5 g/L葡萄糖，5 mM MgCl2的DPBS磷酸緩沖液。結(jié)合緩沖液： 0.1 mg/ml 酵母 tRNA，1 mg/ml BSA 的洗滌緩沖液。捕獲緩沖液：結(jié)合緩沖液和淋巴細(xì)胞分離液以1∶1比例混合組成。

1.6 細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)前先將細(xì)胞懸液調(diào)整濃度到106/ml，用vybrant DiI或DiD細(xì)胞染色液進(jìn)行染色。染色步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，細(xì)胞在37 ℃染色5 min，洗滌緩沖液洗滌一次，用捕獲緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到106/ml，儲(chǔ)存在冰上備用。

細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)的步驟首先用1 mg/ml親和素在微流控芯片中作用1 min，結(jié)合緩沖液沖洗3次。30 μM生物素標(biāo)記適配子作用1 min，用結(jié)合緩沖液沖洗3次。微泵泵入細(xì)胞混懸液(C666和NP69)到微流體芯片反應(yīng)室內(nèi)，結(jié)合緩沖液沖洗3次，洗脫緩沖液洗脫，熒光顯微鏡觀察捕獲細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 微流體芯片捕獲全血中鼻咽癌細(xì)胞

全血取自健康體檢者的EDTA抗凝血。胰蛋白酶會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損失，因此制備細(xì)胞懸液采用無(wú)酶細(xì)胞消化液進(jìn)行消化細(xì)胞，獲得的單個(gè)鼻咽癌細(xì)胞加入健康體檢者全血中，通過(guò)微流體芯片捕獲鼻咽癌細(xì)胞，計(jì)算最終鼻咽癌細(xì)胞捕獲效率。全血中鼻咽癌細(xì)胞的終濃度為10、100、1 000、10 000個(gè)細(xì)胞/ml，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

用微泵將細(xì)胞懸液或全血標(biāo)本經(jīng)過(guò)微流體裝置的進(jìn)樣口輸送到反應(yīng)室，連接反應(yīng)室出樣口的是細(xì)胞收集器。為了避免全血的性狀改變，全血腫瘤細(xì)胞分離過(guò)程中沒(méi)有加入緩沖液。為防止細(xì)胞在泵入過(guò)程中濃度不均一，在細(xì)胞出入端全血中放入微型磁力攪拌棒，全血細(xì)胞在出入過(guò)程中不會(huì)下沉且保持濃度均一。

1.8 臨床標(biāo)本的收集及檢測(cè)

抽取患者及健康體檢者5 ml外周血置于 EDTA抗凝管，4 ℃保存?zhèn)溆?。?.6的方法捕獲保存的外周血細(xì)胞，洗脫反應(yīng)室內(nèi)細(xì)胞離心計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 微流體對(duì)靶細(xì)胞的分離

用鼻咽癌細(xì)胞C666作為靶細(xì)胞，鼻咽正常細(xì)胞NP69作為對(duì)照細(xì)胞，用結(jié)合了生物素標(biāo)記的適配子的微流體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的富集。1 ml的樣本中含有靶細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的比為1∶1 000，終細(xì)胞數(shù)為106，實(shí)驗(yàn)前分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行預(yù)染，鼻咽癌細(xì)胞C666用Vybrant DiI預(yù)染，染色后細(xì)胞顏色為紅色，鼻咽正常細(xì)胞NP69用Vybrant DiD 染色，染色后細(xì)胞顏色為藍(lán)色。經(jīng)過(guò)微流體芯片富集后熒光顯微鏡計(jì)數(shù)靶細(xì)胞的捕獲效率達(dá)到96%。

2.2 全血鼻咽癌細(xì)胞的分離

模擬分離患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞，將培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞加入到收集的外周血中，1 ml外周血中加入不等數(shù)量的鼻咽癌細(xì)胞C666，用微流體裝置進(jìn)行鼻咽癌細(xì)胞分離富集，鼻咽癌細(xì)胞的捕獲效率均可以達(dá)到90%以上，不同細(xì)胞含量的的微流體捕獲細(xì)胞數(shù)量如圖1，從圖上可以看出微流體裝置檢測(cè)外周血的范圍為10～10 000個(gè)。

2.3 初治鼻咽癌患者外周血檢測(cè)結(jié)果

比較鼻咽癌患者和健康體檢者外周血經(jīng)過(guò)微流體芯片檢測(cè)收獲的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者外周血收獲的細(xì)胞數(shù)明顯高于健康體檢者，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖1 全血標(biāo)本中鼻咽癌細(xì)胞捕獲范圍

圖2 鼻咽癌初治患者和健康對(duì)照組捕獲細(xì)胞比較

3 討論

腫瘤的液態(tài)活檢是目前腫瘤診斷與治療研究的熱點(diǎn)，腫瘤患者的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)[3-4]。目前對(duì)CTC的檢測(cè)方法主要有①流式熒光檢測(cè)儀(Luminex100TM多功能流式點(diǎn)陣儀)，主要檢測(cè)乳腺癌外周血中8種循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因；②免疫磁珠分離細(xì)胞，將單抗連接在磁珠上對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行分離，可以從106-7單核細(xì)胞中分離出1個(gè)腫瘤細(xì)胞；③基于免疫磁性分離原理發(fā)展起來(lái)的CellSearch系統(tǒng)[5]，它是一種半自動(dòng)的CTC檢測(cè)儀，將epCAM包被于磁珠表面分離CTC,目前已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于監(jiān)測(cè)乳腺癌預(yù)后及治療效果;④膜過(guò)濾法，通過(guò)腫瘤細(xì)胞體積大于外周血細(xì)胞而把腫瘤細(xì)胞分離出來(lái)，再用抗體標(biāo)記識(shí)別腫瘤細(xì)胞。以上這些方法(除基因檢測(cè)外)主要采用在具有高親和力的抗體(CK8、 CK18、CK19、epCAM)捕獲計(jì)數(shù)CTC[6-8]。目前鑒定出能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株的抗體非常少，抗體存在高水平的脫靶交叉反應(yīng)[9]，需要特定的條件保持蛋白探針的功能活性是以抗體為基礎(chǔ)的捕獲CTC方法的主要缺陷，同時(shí)也限制了這項(xiàng)技術(shù)在臨床中對(duì)多種腫瘤的檢測(cè)。

相對(duì)于抗體適配子具有更好的親和力更高的特異性，容易合成保存運(yùn)輸，可以進(jìn)行表面修飾，因此近年來(lái)也有報(bào)道適配子捕獲外周血腫瘤細(xì)胞,其外周血腫瘤細(xì)胞的捕獲效率從70%到98%不等[10-12]。本研究通過(guò)前期研究篩選出的鼻咽癌適配子[13]結(jié)合微流體平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼻咽癌外周血腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，鼻咽癌細(xì)胞的捕獲效率達(dá)到90%，優(yōu)于一些研究報(bào)道的腫瘤細(xì)胞捕獲效率[14]。

本研究證實(shí)了以適配子為基礎(chǔ)的微流體可以分離全血中的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)用微繞流芯片對(duì)臨床標(biāo)本和健康對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20例健康對(duì)照組外周血中捕獲細(xì)胞數(shù)為0到1，鼻咽癌初治患者照外周血捕獲細(xì)胞數(shù)從2個(gè)到93個(gè)不等，對(duì)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞數(shù)適配子微流體以其檢測(cè)標(biāo)本不需要預(yù)處理，檢測(cè)速度快，檢測(cè)下線低等優(yōu)勢(shì)將在臨床診斷中有廣闊的前景。

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