李連進(jìn) 佟建洲 孫文棟 張向前

為了對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中PI3K/AKT通路的作用進(jìn)行探討，進(jìn)而將新的靶點提供給臨床治療腦膠質(zhì)瘤的工作，本研究探討了人腦膠質(zhì)瘤中PI3K/AKT通路蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取我院2014年5月至2016年5月收治的腦膠質(zhì)瘤患者84例，將其人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本用手術(shù)切除下來，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實為膠質(zhì)瘤標(biāo)本，均用10%甲醛固定，石蠟包埋切為4 μm厚的片，所有患者均知情同意。依據(jù)病理分級將這些患者分為低惡性組(Ⅰ～Ⅱ級，n=42)和高惡性組(Ⅲ～Ⅳ級，n=42)。低惡性組患者中男性25例，女性17例，平均(45.2±10.4)歲；腫瘤類型：6例毛細(xì)胞性性細(xì)胞瘤，16例纖維型星形細(xì)胞瘤，8例原漿型星形細(xì)胞瘤，6例少突膠質(zhì)瘤，6例少突星形細(xì)胞瘤；病理分級：6例Ⅰ級，36例Ⅱ級。高惡性組患者中男性23例，女性19例，平均(46.1±10.1)歲；腫瘤類型：7例毛細(xì)胞性性細(xì)胞瘤，15例纖維型星形細(xì)胞瘤，9例原漿型星形細(xì)胞瘤，6例少突膠質(zhì)瘤，5例少突星形細(xì)胞瘤；病理分級：8例Ⅲ級，34例Ⅳ級。將這些患者作為腦膠質(zhì)瘤組，另選取我院同期采集的40例正常腦組織作為正常對照組。3組標(biāo)本的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

購買Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)的工作濃度為1∶100的兔抗人濃縮型多克隆抗體PI3K，Bioworld Technology公司生產(chǎn)的工作濃度為1∶100的兔抗人濃縮型多克隆抗體AKT，上?；蚩萍加邢薰旧a(chǎn)的即用型EnVision及鼠抗人單克隆抗體PTEN即用型試劑盒，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DAB顯色試劑盒。連續(xù)切石蠟標(biāo)本為3張切片，厚度為4 μm，運用免疫組化Envision二步法對其進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化光鏡分析：PI3K、AKT、PTEN蛋白主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。由2名病理醫(yī)師閱片并評分，在此過程中分別運用雙盲法和雙評分半定量法。光鏡下對8個高倍視野進(jìn)行隨機觀察，將4個高倍視野中染色陽性百分率記錄下來，積分標(biāo)準(zhǔn)為靶細(xì)胞陽性率0、1%～10%、11%～50%、51%～80%、>80%分別評定為0分、1分、2分、3分、4分。依據(jù)切片中細(xì)胞顯色染色深淺情況為顯色度積分，細(xì)胞無淺色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色分別評定為0分、1分、2分、3分，最后將兩項分相乘，分為陰性組(-)、弱陽性組(+)、陽性組(++)、強陽性組(+++)4組，分別評定為0分、1～2分、3～4分、>4分[1]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

在計算機中輸入實驗數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS 19.0 for Windows，用χ2檢驗?zāi)z質(zhì)瘤不同病理分級與正常腦組織中PI3K、AKT、PTEN蛋白的表達(dá)，用Pearson卡方、Fisher精確概率法檢驗理論值，用Spearman等級相關(guān)分析對PI3K、AKT、PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤不同病理分級與正常腦組織中PI3K、AKT、PTEN蛋白表達(dá)比較

腦膠質(zhì)瘤組PI3K、AKT陽性率均顯著高于正常對照組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于正常對照組(P<0.05)。高惡性組PI3K、AKT陽性率均顯著高于低惡性組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于低惡性組(P<0.05)。高惡性組、低惡性組PI3K、AKT陽性率均顯著高于正常對照組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于正常對照組(P<0.05)，見表1。

表1 膠質(zhì)瘤不同病理分級與正常腦組織中PI3K、AKT、PTEN蛋白表達(dá)比較(例，%)

注：#為與低惡性組比較，P<0.05；*為與正常對照組比較，P<0.05。

2.2 人腦膠質(zhì)瘤中PI3K、AKT、PTEN蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性

84例人腦膠質(zhì)瘤組織中，66例PI3K、AKT蛋白共同陽性表達(dá)，10例共同陰性表達(dá)。人腦膠質(zhì)瘤中PI3K、AKT與PTEN蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-4.56,P<0.05)，而PI3K與AKT呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(γ=3.36,P<0.05)，見表2。

表2 人腦膠質(zhì)瘤中PI3K、AKT、PTEN蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性/例

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病是多因素多基因作用的結(jié)果，從本質(zhì)上來說，細(xì)胞增殖、分化、凋亡均會在各種致癌物誘發(fā)細(xì)胞癌變的過程中失控，而細(xì)胞的信道轉(zhuǎn)導(dǎo)對這些過程起到了決定性作用[2]。很多相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[3-4]，在人腦惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/AKT信號通路可能發(fā)揮著極為重要的作用。PI3K/AKT信號通路一方面對細(xì)胞的增殖、凋亡造成直接而深刻的影響，另一方面也對腫瘤的生長、對化療的反應(yīng)造成直接而深刻的影響，針對此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑也將顯著的化療增敏作用顯示了出來，其在細(xì)胞內(nèi)將對凋亡進(jìn)行抑制、為增殖提供良好的前提條件的關(guān)鍵作用充分發(fā)揮出來的途徑為對下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)進(jìn)行影響[5]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6-8]，白血病、結(jié)腸癌等一些腫瘤細(xì)胞耐藥性受到PI3K/AKT途徑的直接而深刻的影響。在白血病等腫瘤的化療過程中，常規(guī)化療藥物和針對該途徑的抑制劑的協(xié)同作用已經(jīng)將促進(jìn)化療效率顯著提升、耐藥顯著降低的作用顯示了出來[9]。但是目前，還很少有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究報道腦膠質(zhì)瘤組織中該信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)[10]。

本研究結(jié)果表明，腦膠質(zhì)瘤組PI3K、AKT陽性率均顯著高于正常對照組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于正常對照組(P<0.05)，其中高惡性組PI3K、AKT陽性率均顯著高于低惡性組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于低惡性組(P<0.05)，高惡性組、低惡性組PI3K、AKT陽性率均顯著高于正常對照組(P<0.05)，PTEN陽性率顯著低于正常對照組(P<0.05)，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還表明，84例人腦膠質(zhì)瘤組織中，66例PI3K、AKT蛋白共同陽性表達(dá)，10例共同陰性表達(dá)。人腦膠質(zhì)瘤中PI3K、AKT與PTEN蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而PI3K與AKT呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，說明在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K、AKT與PTEN可能相互拮抗，PTEN表達(dá)缺失可能受到AKT表達(dá)過度的直接而深刻的影響，三者可能共同為膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展提供了良好的前提條件。同時，在膠質(zhì)瘤的治療中，在PTEN失活的情況下，PI3K、AKT可稱為2個靶點。

總之，人腦膠質(zhì)瘤中PI3K/AKT通路蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)提升，與膠質(zhì)瘤病理分級呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，值得臨床充分重視。

[1] 劉書哲,高偉敏,檀艷麗.TIP30在腦星形細(xì)胞瘤中表達(dá)及意義〔J〕.中國公共衛(wèi)生,2010,26(9):1164-1165.

[2] 劉曉智,姜忠敏,陳 鐳,等.miR-7沉默EGFR/PI3K 通路逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的惡性表型〔J〕.腫瘤,2011,31(11):987-992.

[3] 胡瑩瑩,劉新會,羅榮城.TIP30在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志.2013,13(5):595-597.

[4] 祝寶欽,黃燕芳,楊曉煜.印跡基因Igf2 對胎盤發(fā)育和胎兒生長的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(14):2778-2780.

[5] 何慶璋,懷建國.PTEN,Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義〔J〕.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,31(1):24-27.

[6] 王 輝,張梅美,陳春輝,等.解聚素-金屬蛋白酶19水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷及預(yù)后的相關(guān)性〔J〕.實用癌癥雜志,2014,30(12):1529-1531.

[7] 由麗娜,姜海東.NOX及細(xì)胞內(nèi)ROS與膠質(zhì)瘤增殖及惡性程度的關(guān)系〔J〕.實用癌癥雜志,2013,28(4):347-349.

[8] Suvasini R,Shruti B,Thota B,et al.Insulin growth factor-2 binding protein 3 (IGF2BP3) is a glioblastoma-specific marker that activates phosphatidylinositol 3-kinase/mitogen-activated protein kinase(PI3K1/MAPK)pathways by modulating IGF-2〔J〕.J Biol Chem,2011,286(29):25882-25890.

[9] Sun Y,Zhang W,Chen D,et al.A glioma classification sc-heme based on coexpression modules of EGFR and PDGFRA〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(9):3538-3543.

[10] Wu L,Li G,Feng D,et al.MicroRNA-21 expression is associated with overall survival in patients with glioma〔J〕.Diagn Pathol,2013,8(10):200.