孫艾明， 王 劍， 董 瑩， 陳夢(mèng)妮， 徐艷春， 鄧 艷， 毛祥華

(1. 大理大學(xué) 病原與媒介生物研究所普洱分部，普洱 665000； 2. 云南省寄生蟲病防治所 云南省瘧疾研究中心 云南省蟲媒傳染病防控研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，普洱 665000)

青蒿素是中國(guó)藥學(xué)工作者20世紀(jì)70年代從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的倍半萜內(nèi)酯類化合物，是一種高效、迅速且副作用小的新型抗瘧藥[1-2]。世界衛(wèi)生組織推薦以青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)作為治療惡性瘧疾最有效的一線抗瘧藥，在降低瘧疾相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率中起到了不可或缺的作用，顯著降低了全球范圍內(nèi)的瘧疾負(fù)擔(dān)[3]。但自2008年首次在柬埔寨地區(qū)報(bào)道青蒿素耐藥性蟲株以來(lái)[4]，東南亞的緬甸、泰國(guó)邊境等地也陸續(xù)檢測(cè)到青蒿素耐藥性蟲株[4-9]，目前，柬埔寨、老撾、緬甸、泰國(guó)及我國(guó)云南省處于青蒿素耐藥性泛濫的中心地帶[10-11]。云南省的惡性瘧流行區(qū)主要局限在中緬邊境地區(qū)[12]，其中80%以上的惡性瘧疾病例在緬甸境內(nèi)感染形成，而緬甸大部分地區(qū)均為青蒿素耐藥性惡性瘧流行區(qū)[13]，青蒿素使用歷史已超過(guò)30年[14]，持續(xù)的青蒿素類耐藥性惡性瘧原蟲的傳播將對(duì)全球瘧疾控制和消除造成嚴(yán)重威脅。

青蒿素及其衍生物是惡性瘧原蟲磷脂酰肌醇-3-激酶(Plasmodiumfalciparumphosphatidylinositol-3-kinase,PfPI3K) 的強(qiáng)效抑制劑[15]，Mbengue等[16]發(fā)現(xiàn)，PfKelch13的某些位點(diǎn)突變，可通過(guò)PfPI3K的信號(hào)變化，介導(dǎo)青蒿素耐藥性產(chǎn)生。Imwong等[17]、Wang等[18]和Huang等[19]進(jìn)一步證實(shí)，緬甸惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域的F446I突變型基因，對(duì)青蒿素耐藥性產(chǎn)生有一定影響，但研究均未對(duì)兩者間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，針對(duì)我國(guó)云南省的惡性瘧報(bào)告病例的類似研究更是匱乏。本研究采用群體遺傳學(xué)評(píng)價(jià)與遺傳關(guān)聯(lián)性研究相結(jié)合的方法，對(duì)惡性瘧原蟲不同種群分離株的PfKelch13基因分化進(jìn)行了分析，間接評(píng)估了云南省惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的關(guān)聯(lián)程度，為惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性分子監(jiān)測(cè)標(biāo)志提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 研究對(duì)象及血樣采集

1.1.1 云南省瘧疾報(bào)告病例血樣來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所采用的病例血樣來(lái)源于2013年1月—2015年12月，經(jīng)云南全省衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)參照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS259—2006)》[20]和經(jīng)基因檢測(cè)方法[21]確診，屬于“中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”登記管理的惡性瘧疾報(bào)告病例，采其0.6 mL靜脈血制作濾紙血膜，采集范圍見圖1。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查判定其感染來(lái)源地，瘧疾發(fā)作潛伏期之前無(wú)云南省外流動(dòng)史者為云南本地病例，有緬甸、非洲國(guó)家流動(dòng)史者為緬甸、非洲感染病例。

1.1.2 緬甸境內(nèi)病例血樣來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所采用的病例血樣來(lái)源于2009年1月—2012年12月，經(jīng)顯微鏡檢查和基因檢測(cè)確診，且長(zhǎng)期定居緬甸拉咱及周邊的緬籍惡性瘧現(xiàn)癥病例，采其靜脈血0.6 mL制作濾紙血膜，采集范圍見圖1。

圖1 本研究惡性瘧現(xiàn)癥病例血樣采集范圍

Fig 1 The range of blood sample collection ofPlasmodiumfalciparumin this study

注：“”為云南疫情病例血樣采集中心；“”為緬甸境內(nèi)血樣采集中心；“”為地州、縣政府駐地

1.2 青蒿素敏感性體內(nèi)試驗(yàn)

緬甸境內(nèi)病例血樣年齡為2～60歲，2周內(nèi)無(wú)抗瘧藥或/和抗菌藥服藥史者同時(shí)接受青蒿琥酯耐藥性體內(nèi)測(cè)試。藥物及治療方案參考文獻(xiàn)[22]，療效評(píng)價(jià)采用參考文獻(xiàn)[23]，以上內(nèi)容均獲得病人知情和簽字認(rèn)可。

2 方法

2.1 瘧原蟲DNA提取

參照試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 巢式PCR擴(kuò)增瘧原蟲PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域

參照文獻(xiàn)[8，24-25]的引物和條件擴(kuò)增PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域，目的基因片段749～850 bp[26]。

2.3 PfKelch13基因序列多態(tài)性及突變位點(diǎn)進(jìn)化分析

測(cè)序結(jié)果在DNAStar Lasergene 7.1拼接或轉(zhuǎn)換后經(jīng)NCBI BLAST與惡性瘧原蟲PfKelch13基因參比序列(ID：PF3D7-1343700)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)正常的DNA序列在MEGA5.04軟件進(jìn)行氨基酸轉(zhuǎn)換和文件格式調(diào)整。用Clustal X2.1軟件多重比對(duì)DNA序列，確認(rèn)錯(cuò)義突變和同義突變。PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域446、578、556、676、458、574、16、469、449、566、538、481、483、492和76等15個(gè)等位基因位點(diǎn)的野生型基因?yàn)椤癋446A578E556A676N458P574S16C469G449V566G538A481F483L492Y76”。用Arlequin 3.01軟件分析基因片段單倍型及期望雜合度(He)、基因多態(tài)系數(shù)(H)和群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)等，F(xiàn)st采用分子方差分析法(AMOVA)計(jì)算，檢驗(yàn)水平為α=0.05。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Epi Data 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，在IBM?SPSS?21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變型構(gòu)成比進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平為α=0.05，并計(jì)算惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變型與青蒿素治療失敗的比值比(OR)及其95%CI。

3 結(jié)果

3.1 樣本信息及PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增

云南省惡性瘧疾報(bào)告病例血樣202份，其中192份PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，測(cè)序成功190例。緬甸境內(nèi)惡性瘧病例血樣382份， 289份PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，測(cè)序成功194例，其中，包括60例接受青蒿琥酯療效評(píng)價(jià)病例血樣的53條序列，樣本使用流程如圖2。

惡性瘧原蟲分離株的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖3，在750 bp處可見電泳條帶。

圖2 本研究惡性瘧現(xiàn)癥病例的血樣使用流程圖

圖3 惡性瘧現(xiàn)癥病例血樣PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域巢式PCR擴(kuò)增電泳圖

M：DNA標(biāo)志物；1：惡性瘧原蟲陽(yáng)性對(duì)照；2：間日瘧原蟲陽(yáng)性對(duì)照；3：第1輪PCR陰性對(duì)照；4：第2輪PCR陰性對(duì)照；5:陰性樣本；6～13：陽(yáng)性樣本

3.2 PfKelch13基因突變型分析

190例測(cè)序成功的云南省瘧疾報(bào)告病例DNA序列中，66例序列檢出10種氨基酸突變型,均為單位點(diǎn)錯(cuò)義突變，突變率 34.7%(66/190)，10種氨基酸突變型為F446I、A578S、N458Y、P574L、A676D、G449A、C469Y、V566I、E556D和S16L，各型突變所占比如圖4。

圖4 云南省和緬甸兩地感染惡性瘧原蟲PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域氨基酸編碼突變類型及比例(n=16)

“Δ”：云南分離株構(gòu)成比；“*”：緬甸分離株構(gòu)成比

測(cè)序成功的194例緬甸境內(nèi)病例DNA序列中，114例序列檢出12種氨基酸突變型，均為錯(cuò)義突變，突變率為58.8%(114/194)，且每例序列均為單一突變。12種突變型為F446I、P574L、C469Y、A676D、A481V、E556D、N458Y、F483S、L492S、G538V、G449A和Y76K，各型突變所占比例如圖4。

3.3 PfKelch13基因突變及單倍型分析

測(cè)序成功的云南省病例血樣的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域DNA序列共有13種單倍型，He、H分別為0.0481和0.5183，緬甸境內(nèi)病例血樣的PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域DNA序列共有19種單倍型，He、H分別為0.0440和0.6510。兩地惡性瘧原蟲種群間的Fst=0.0410(P<0.05)(見表1)。來(lái)自群體內(nèi)的變異占95.90%，群體間變異比例占4.10%，群體內(nèi)遺傳變異大于群體間遺傳變異。

表1 云南及緬甸境內(nèi)惡性瘧病例分離株P(guān)fKelch13基因 kelch結(jié)構(gòu)域的等位多態(tài)性分析

“※”：百分?jǐn)?shù); “Δ”:1 組與2組配對(duì)分析; “*”:P<0.05

3.4 PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)突變與青蒿素耐藥性關(guān)聯(lián)程度分析

60例緬甸境內(nèi)病例接受青蒿琥酯療效評(píng)價(jià)，其中49例完成全程隨訪。完成全程隨訪病例中，28例病例血樣檢出PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)存在5種位點(diǎn)突變，突變率為57.1%(28/49)，突變型為F446I 、C469Y 、A676D 、N458Y 和P574L，所占比例分別為46.9%(23/49)、4.1%(2/49)、2.0%(1/49)、2.0%(1/49)和2.0%(1/49)。

緬甸境內(nèi)惡性瘧病例青蒿琥酯治療失敗與PfKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)程度分析如表2。

表2 緬甸境內(nèi)病例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fKelch13基因kelch結(jié)構(gòu)域突變位點(diǎn)與青蒿素耐藥性關(guān)聯(lián)程度分析

4 討論

本研究中，盡管云南報(bào)告病倒惡性瘧原蟲種群與緬甸境內(nèi)病例惡性瘧原蟲種群PfKelch13基因的位點(diǎn)突變類型、單倍型種類及其數(shù)量均存在不同(表1)，但兩種群間的遺傳分化系數(shù)較小(Fst=0.0410，P<0.05)，且群體內(nèi)變異貢獻(xiàn)率占95.9%，群體間變異貢獻(xiàn)率只占4.1%，故可認(rèn)為云南及緬甸境內(nèi)惡性瘧疾病例種群具有相似的遺傳背景，因而以緬甸境內(nèi)病例蟲株求得的PfKelch13基因突變對(duì)青蒿素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)程度(表2)，可以用于評(píng)估云南瘧疾報(bào)告病例PfKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的關(guān)聯(lián)性，即感染PfKelch13基因F446I突變型或感染所有突變型位點(diǎn)的惡性瘧蟲株病例，其青蒿素治療無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)是感染PfKelch13基因野生型惡性瘧原蟲的1.640倍(95%CI：1.284～2.095)和1.840倍( 95%CI：1.412～2.398)，其中，單一F446I突變型位點(diǎn)是PfKelch13基因的主導(dǎo)型突變(圖4)，與Tun等[14]、Wang等[18]、Huang等[19]和Ye等[27]的研究結(jié)果一致。雖然本研究中的關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)并不能完全揭示基因突變與耐藥性產(chǎn)生的因果關(guān)系，但仍提示PfKelch13基因多態(tài)性突變位點(diǎn)特別是F446I突變位點(diǎn)可以作為云南地區(qū)的惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性分子水平的監(jiān)測(cè)標(biāo)志。

本研究的局限性也不容忽視。首先，我們進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)性研究的樣本量仍不足夠大，PfKelch13基因突變的危險(xiǎn)程度如何，需進(jìn)一步進(jìn)行論證；其次，本研究中接受表型測(cè)試的對(duì)象為緬甸境內(nèi)的外國(guó)人種，與云南本地瘧疾報(bào)告病例之間可能存在遺傳異質(zhì)性，加之本實(shí)驗(yàn)中的表型研究地區(qū)——緬甸拉咱仍為瘧疾高度流行區(qū)，因此，不同惡性瘧流行區(qū)使用本研究所獲得的微觀評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)須謹(jǐn)慎理解。下一步除需擴(kuò)大同質(zhì)研究樣本量外，可適當(dāng)開展相關(guān)的系統(tǒng)分析研究，以期高效揭示PfKelch13基因突變與青蒿素耐藥性之間的遺傳關(guān)聯(lián)性。

致謝：感謝云南省德宏、保山、昆明、普洱、臨滄、大理、怒江、麗江、西雙版納、玉溪、楚雄、紅河、昭通、迪慶、曲靖、文山16個(gè)州/市級(jí)及其轄區(qū)內(nèi)各縣級(jí)疾病預(yù)防控制中心的傾力支持。

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