高麗娟， 高建萍， 馬 凱， 李賽娜， 張貴鋒

(1. 北京市理化分析測(cè)試中心 北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心， 北京 100089； 2. 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所， 北京 100190)

微生物檢測(cè)在應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)于微生物的檢測(cè)和鑒定技術(shù)多基于微生物的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生理生化、脂肪酸組成以及核酸檢測(cè)等方法，這些方法往往耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低，特異性差。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于質(zhì)譜的檢測(cè)方法具有快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，采用質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行鑒定微生物主要基于質(zhì)譜圖中是否存在特異性的生物標(biāo)記物的分子離子，不同微生物具有不同的質(zhì)譜圖，即微生物指紋圖譜[1-3]。微生物的質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)流程包括樣本的采集和制備，整個(gè)過程在數(shù)分鐘內(nèi)完成，并可以實(shí)現(xiàn)高通量分析。質(zhì)譜分析作為一種通用技術(shù)，可以檢測(cè)到所有類型的病原體，包括植物細(xì)菌、真菌及其孢子和寄生原生動(dòng)物等[4-6]。

腸道微生物對(duì)人體的健康至關(guān)重要，如對(duì)人體免疫力、新陳代謝、炎癥性疾病甚至心情等都有不同程度的影響。腸道微生物的豐度、多樣性以及構(gòu)成變化對(duì)人體健康狀況的影響近年來(lái)引起廣泛關(guān)注[7-8]。嬰幼兒發(fā)育的過程中，腸道微生物菌群也是在逐漸成熟的，受母體、分娩、喂養(yǎng)、醫(yī)療、環(huán)境等因素影響，研究腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化是近年來(lái)腸道微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。因此，對(duì)于成長(zhǎng)過程中嬰幼兒腸道內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的微生物菌落，則采用單一模式的質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)行微生物菌落分析存在一定的局限性[9-12]。

本研究擬采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)對(duì)不同年齡的嬰幼兒腸道微生物組成進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)首先收集了100個(gè)不同年齡的嬰幼兒糞便進(jìn)行檢測(cè)，按照年齡分成了0～1歲、1～2歲和2～3歲3個(gè)年齡段，比較了基于MALDI-TOF MS和HPLC-MS分析結(jié)果的差異，為進(jìn)一步研究嬰幼兒發(fā)育過程中腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈購(gòu)自ThermoFisher公司，α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)購(gòu)自Bruker公司，其他試劑為市售分析純。實(shí)驗(yàn)樣本為70個(gè)0～1歲、1～2歲和2～3歲3個(gè)年齡段嬰幼兒的糞便，樣本來(lái)自于北京兒童醫(yī)院。

1.2 分析儀器

高效液相色譜儀為美國(guó)Agilent 公司的HPLC1100，PDA 檢測(cè)器為美國(guó)熱電公司的UV6000 檢測(cè)器，離子阱質(zhì)譜為美國(guó)熱電公司的LCQ DecaXP質(zhì)譜，MALDI-TOF MS 為德國(guó)布魯克公司的AutoFlex III質(zhì)譜。

1.3 樣本處理方法

1)取嬰幼兒糞便1 g，加入5 mL生理鹽水，混合均勻后實(shí)驗(yàn)80目濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集透過液，取1 mL，在12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2)MALDI-TOF MS分析樣本點(diǎn)靶之前進(jìn)行渦旋混合，取1 μL樣本點(diǎn)靶，自然風(fēng)干后取2 μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)靶，自然風(fēng)干，質(zhì)譜分析前儀器的質(zhì)量數(shù)利用外標(biāo)法，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物進(jìn)行校正。

3)HPLC-MS分析中，將糞便樣本細(xì)胞破碎，靜置自然沉降，取100 μL上清液調(diào)pH至8.0，與50 μL胰蛋白酶溶液(1 μg/μL，0.05 mol/L NH4HCO3，pH 8.0)，混合均勻后在37℃酶解處理24 h，加5 μL 4 mol/L DTT還原二硫鍵，離心(10 000 r/min，10 min)，酶解產(chǎn)物采用HPLC-MS分析。

1.4 分析方法

1)MALDI-TOF質(zhì)譜分析方法。脈沖激光(337 nm)離子解析電離源；離子加速電壓20 kV；平均每次測(cè)定的激光脈沖次數(shù)為100次/s；質(zhì)譜信號(hào)為多次累加掃描；質(zhì)譜掃描范圍m/z1600～24 000；采用正離子線性模式。選擇α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)作為基質(zhì)，用V(0.1% TFA的超純水)∶V(CH3CN)=1∶1的溶液將CHCA配成濃度為5 g/L的基質(zhì)溶液，基質(zhì)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2)HPLC-MS分析方法。色譜條件，C18柱 (75 μm ID×15 cm, 5 μm, 120 ?)；流動(dòng)相A為水(含0.1% 甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)；梯度：0～3 min：3%～6%B，3～50 min：6%～25%B，50～58 min：25%～35%B，58～63 min：35%～80%B，63～73 min：80%B；流速300 nL/min；波長(zhǎng)280 nm。進(jìn)樣量50 μL。質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，噴霧電壓3.5 kV，離子導(dǎo)入電壓(Skimmer 電壓) 20 V，殼氣流速10 arb，輔助氣流速2 arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度300℃。離子監(jiān)測(cè)模式參數(shù)中共設(shè)立2個(gè)掃描段，第一段監(jiān)測(cè)為一級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍為m/z=350～1550，采用正離子監(jiān)測(cè)模式，分辨率設(shè)為12 000；第二段監(jiān)測(cè)采用數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)質(zhì)譜的掃描(Data dependent MS/MS)，用于掃描在第一段中已確定質(zhì)量數(shù)離子的二級(jí)質(zhì)譜，離子帶電荷數(shù)默認(rèn)值為2個(gè)，二級(jí)質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)裂分中的能量值均設(shè)置為35%。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Mascot 軟件進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)為從Swiss-Prot中下載的包括糞便中已發(fā)現(xiàn)的全部蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析

為了完整測(cè)定糞便樣本的分子量信息，實(shí)驗(yàn)將糞便樣本渦旋混合之后直接點(diǎn)靶，進(jìn)行MALDI-TOF分析。取1 μL渦旋混合之后的樣本點(diǎn)靶，自然風(fēng)干后取2 μL CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)靶，自然風(fēng)干，進(jìn)行MALDI-TOF分析。圖1～3分別為0～1歲、1～2歲、2～3歲部分樣本分子量分布圖。

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同年齡段的樣本的分子質(zhì)量分布及檢測(cè)出峰的個(gè)數(shù)進(jìn)行了匯總，結(jié)果表明0～1歲嬰幼兒糞便中檢出峰的個(gè)數(shù)主要分布在4～7個(gè)，其中兩個(gè)樣本出峰最多是11個(gè)，平均每個(gè)樣本出峰5.5個(gè)；樣本的分子質(zhì)量分布主要為3000～14 000 u，分子質(zhì)量最低為2378 u，最高為23 541 u。1～2歲嬰幼兒糞便中檢出峰的個(gè)數(shù)主要分布在6～8個(gè)，樣本出峰最多達(dá)13個(gè)，平均每個(gè)樣本出峰6.1個(gè)；樣本的分子質(zhì)量分布主要為3000～14 000 u，分子質(zhì)量最低為1897 u的峰，最高為15 073 u。2～3歲嬰幼兒糞便中檢出峰的個(gè)數(shù)主要分布在6～10個(gè)，樣本出峰最多是15個(gè)，平均每個(gè)樣本出峰6.5個(gè)；樣本的分子質(zhì)量分布主要為3000～14 000 u，分子質(zhì)量最低1182 u的峰，最高為15 022 u。綜上所述，2～3歲年齡段的嬰幼兒檢出峰個(gè)數(shù)最多，0～1歲年齡段的嬰幼兒檢測(cè)出的分子質(zhì)量分布范圍最廣。

圖1 0～1歲嬰幼兒糞便樣本MALDI-TOFMS分析圖譜

圖2 1～2歲嬰幼兒糞便樣本MALDI-TOFMS分析圖譜

圖3 2～3歲歲嬰幼兒糞便樣本MALDI-TOFMS分析圖譜

實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA聚類分析，圖4為3組不同年齡段的嬰幼兒糞便TOF數(shù)據(jù)PCA分析圖。結(jié)果表明，0～1歲嬰幼兒糞便樣本分布相對(duì)集中，1～2歲嬰幼兒糞便樣本分布比0～1歲的分布范圍寬，2～3歲嬰幼兒糞便樣本的分布最廣。

文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)菌落進(jìn)行菌種鑒定過程中，對(duì)常見細(xì)菌和酵母菌等高豐度微生物的鑒定率較高。由于嬰幼兒糞便中不同的微生物豐度存在一定差異，直接進(jìn)行不同樣本分析質(zhì)譜圖中特征離子種類波動(dòng)范圍較大。0～1歲嬰幼兒糞便樣本中可以確定的微生物主要包括大腸桿菌、酵母菌、白色念珠菌等；1～2歲嬰幼兒糞便中主要有紅色毛麟菌、大腸桿菌、白色念珠菌、酵母菌等；2～3歲嬰幼兒糞便中主要有雙歧桿菌、白色念珠菌和大腸桿菌等。

圖4 3組不同年齡段的嬰幼兒糞便TOF數(shù)據(jù)PCA分析圖

圖5 3個(gè)不同年齡階段樣本的總離子流圖

A: 0～1歲; B:1～2歲; C: 2～3歲

圖6 B61樣本中m/z 872.41的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 液質(zhì)聯(lián)用法識(shí)別嬰幼兒糞便中微生物

實(shí)驗(yàn)首先將嬰幼兒糞便樣本進(jìn)行細(xì)胞破碎，靜置0.5 h，使糞便中的固體顆粒物質(zhì)自然沉降，取上清液調(diào)節(jié)pH 值，酶解，HPLC-MS分析。圖5為酶解樣本的HPLC-MS分析的總離子流圖。樣本總離子流圖中檢測(cè)出離子m/z872.41的提取離子流圖(圖6)，表明B61樣本中存在m/z872.41的離子，其經(jīng)色譜柱分離后保留時(shí)間為11.02 min。

利用Mascot軟件搜索離子m/z872.41的pep_expect的值<0.01，表明數(shù)據(jù)可靠。m/z872.41的二級(jí)質(zhì)譜圖與多肽QDAGDAAPK理論二級(jí)質(zhì)譜碎片離子匹配，該多肽序列與土霉菌中的局部序列一致，表明樣本中存在土霉菌；實(shí)驗(yàn)使用相同的方法對(duì)不同樣本進(jìn)行分析，并確定了3個(gè)樣本中的主要微生物組分，識(shí)別結(jié)果見表1。

2.3 分析方法比較

鑒于MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)菌落分析中存在的波動(dòng)范圍大和結(jié)果不穩(wěn)定等問題，試驗(yàn)對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行了培養(yǎng)，并進(jìn)一步采用MALDI-TOF MS進(jìn)行了分析。結(jié)果表明菌落種類沒有明顯的改變，但信號(hào)強(qiáng)度會(huì)大幅度提升，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性也會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，因此，MALDI-TOF MS對(duì)于高豐度的微生物鑒定具有可操作性，但可檢測(cè)出的微生物數(shù)量較為有限。

表1 0～1歲、1～2歲、2～3歲3個(gè)年齡段糞便樣本中微生物構(gòu)成

—a，暫無(wú)正式中文對(duì)照名

HPLC-MS是基于微生物中不同蛋白質(zhì)的含量變化進(jìn)行檢測(cè)的一種方法，其關(guān)鍵因素為不同微生物中以及同一微生物中不同蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果(表1)表明，基于HPLC-MS檢測(cè)出的微生物種類遠(yuǎn)高于MALDI-TOF MS，其主要因素是基于液質(zhì)的檢測(cè)方法具有較高的靈敏度。盡管微生物的酶解產(chǎn)物中不同種類的蛋白質(zhì)含量存在較大差異，但HPLC-MS是在色譜分離基礎(chǔ)上進(jìn)行的多肽檢測(cè)，因此可以大幅度減少離子化過程中的質(zhì)量歧視效應(yīng)，并增加方法的靈敏度。對(duì)于多元混合的微生物檢測(cè)，HPLC-MS明顯可提升可檢測(cè)的微生物數(shù)量，且方法具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此該方法也適用于未經(jīng)培養(yǎng)的微生物菌落。

[1]RANDAZZO A, SIMON M, Goffinet P, et al. Optimal turnaround time for direct identification of microorganisms by mass spectrometry in blood culture[J]. Journal of Microbiological Methods, 2016, 130: 1-5.

[3]GONZALEZ M D, WEBER C J, BURNHAMC D. Rapid identification of microorganisms from positive blood cultures by testing early growth on solid media using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2016, 85(2): 133-135.

[4]STOPKA S A, MANSOUR T R, SHRESTHA B, et al. Turnover rates in microorganisms by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry and pulse-chase analysis[J]. Analytica Chimica Acta, 2016, 902: 1-7.

[6]RIEGEL P, MOUSSAOUI W, SANGLIER S F, et al. Mass spectrometry and microorganism identification[J]. Médecine et Maladies Infectieuses, 2007, 37(S1):S11-S13.

[7]SALADINO F, POSARELLI E, LUZ C, et al. Influence of probiotic microorganisms on aflatoxins B1 and B2 bioaccessibility evaluated with an simulated gastrointestinal digestion[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2017.

[8]TAKI Y, KENZAKA T, OHATA K, et al. Cause and responsible microorganisms of bacteremia after gastrointestinal surgery[J]. Journal of the American College of Surgeons, 2016, 223(4): e92.

[9]HAYASHI A, AOYAGI H, YOSHIMURA T, et al. Development of novel method for screening microorganisms using symbiotic association between insect and intestinal microorganisms[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007, 103(4): 358-367.

[10]KARIM IKHLAS A E, LINDEN G J, ORR F T, et al. Antimicrobial activity of neuropeptides against a range of micro-organisms from skin, oral, respiratory and gastrointestinal tract sites[J]. Journal of Neuroimmunology, 2008, 200(1-2): 11-16.

[11]MORITA H, TOH H, OSHIMA K, et al. Complete genome sequence of Bifidobacterium breve JCM 1192Tisolated from infant feces[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 210: 81-82.

[12]KONGNUM K, HONGPATTARAKERE T. Cholesterol-lowering mechanism of lactic acid bacteria andBifidobacteriumsp. isolated from breast milk and infant feces[J]. Journal of Biotechnology, 2014, 185(1):S78.

[13]MORITA H, TOH H, OSHIMA K, et al. Complete genome sequence ofBifidobacteriumpseudocatenulatumJCM 1200(T) isolated from infant feces[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 210: 68-69.

[14]MORITA H, TOH H, OSHIMA K, et al. Complete genome sequence ofbifidobacteriumbifidumJCM 1255(T) isolated from feces of a breast-fed infant[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 210: 66-67.

[15]DAVOODABADI A, SOLTAN DALLAL M M, FOROUSHANI A R, et al. Antibacterial activity ofLactobacillusspp. isolated from the feces of healthy infants against enteropathogenic bacteria[J]. Anaerobe, 2015, 34: 53-58.

[16]ALP G, ASLIM B. Relationship between the resistance to bile salts and low pH with exopolysaccharide (EPS) production ofBifidobacteriumspp. isolated from infants feces and breast milk[J]. Anaerobe, 2010, 16(2): 101-105.