胡 莉, 王小紅

(1. 黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院, 駐馬店 463000; 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院, 武漢 430070)

黃曲霉毒素( Aflatoxins，AFs)是一類主要由黃曲霉、寄生曲霉等真菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱，這類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本類似，均含有二呋喃環(huán)和香豆素，前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。目前已經(jīng)分離鑒定出的有將近20種，主要分子型式有B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強(qiáng)，研究最為透徹，也是最具代表性的一種毒素[1]。1993年，AFB1被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research center，IARC)劃為I類致癌物質(zhì)[2-3]，與乙型肝炎病毒一起成為肝癌的兩大誘因[4-5]。然而，食品中的黃曲霉污染非常常見，從農(nóng)作物的生產(chǎn)到轉(zhuǎn)化為食物、從食物鏈的低端到頂端，AFB1都有可能造成淀粉類食品、肉類食品、蛋、奶類食品以及動(dòng)物飼料等的連鎖污染，除此之外，AFB1還可通過皮膚接觸、飲食攝入等一些方式進(jìn)入人和動(dòng)物的機(jī)體。因此，對(duì)食品中黃曲霉毒素定量檢測(cè)變成一項(xiàng)很重要的工作[6]。目前的檢測(cè)方法主要有儀器法和酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]，但前者耗時(shí)、耗力且成本較高、工序繁瑣。目前常采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，然而，該法需要高質(zhì)量的抗體，因此，獲得高質(zhì)量的抗AFB1scFv是上述研究方法的保證。scFv作為小分子功能性抗體，具有多種低成本的表達(dá)方式[9-11]，目前這種重組抗體已經(jīng)獲得許多研究學(xué)者的關(guān)注[12]。

外源蛋白采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，能夠有效避免在原核表達(dá)系統(tǒng)中的不足，表達(dá)的外源蛋白能得到較為完整的加工修飾，其構(gòu)象與天然蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)模式也較為接近，相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的生物活性也較高，因此，真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白越來越受到研究者們的青睞[13]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，可以將甲醇作為碳源使用，因此也叫甲醇營(yíng)養(yǎng)型表達(dá)系統(tǒng)。其內(nèi)有編碼醇氧化酶的AOX1 基因，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源耗盡時(shí)，加入甲醇，AOX1基因會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄醇氧化酶物質(zhì)，該物質(zhì)可以將甲醇轉(zhuǎn)化為醛類物質(zhì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成酵母生長(zhǎng)所需要的能量[14]。其次AOX1是強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠多次有效啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)，使得誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)時(shí)，具有較高的效率和蛋白表達(dá)量[15]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低、繁殖速度快和易于高密度生產(chǎn)發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)使得它的應(yīng)用極為廣闊[16-17]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體的分泌表達(dá)并進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

AFB1購(gòu)于瑞士Alexis公司；畢赤酵母GS115菌株、表達(dá)載體pPICZαA、pET-30a、pET-22b及E.coli菌株Trans5α均為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；AFB1-O-OVA實(shí)驗(yàn)室自制； EasyTaq酶、 Trans5K Plus DNA Marker、Trans2K Plus DNA Marker購(gòu)于中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA 親和層析填料、ECL 顯色液、Page RulerPrestained Protein Ladder購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；雜交瘤細(xì)胞株2C10由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存；YNB、Zeocin購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒小提、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)于杭州AxyGen；所用引物的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；羊抗小鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)于中國(guó)華美生物工程公司； DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、dNTP、 PMD19-T Simple Vector 購(gòu)自TaKaRa公司； DNA凝膠回收純化試劑盒由中國(guó)北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于中國(guó)北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增

以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建的重組載體pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得scFv-2C10片段，并在目的基因兩端分別引入XbalⅠ(NcoⅠ)和EcoRⅠ(XhoⅠ)酶切位點(diǎn)，其次，考慮到后續(xù)的純化工作，在引物設(shè)計(jì)時(shí)特別引入histag 標(biāo)簽，其具有可以特異性的結(jié)合鎳離子的功能，方便重組蛋白的純化和回收。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下所示:

引物1:CATGTCTAGA(CCATGG)CGGAGGTGAAGCTGGTGGAG [劃線處為酶切位點(diǎn)XbalⅠ(NcoⅠ)]

引物2:GCCACCGCCGGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT(劃線處為部分linker序列)

引物3: GGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAA(劃線處為部分linker序列)

引物4: CCGGAATTC(CTAGAG)TTAGTGGTGATGGTGATGATGCTTGGGCTGACCTAGGACAGT(劃線處為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(XhoⅠ)，波浪線為histag 標(biāo)簽)

首先，以引物1和引物2為引物，PCR擴(kuò)增出帶有部分Linker的VH-Linker片段；以引物3和引物4為引物，PCR擴(kuò)增出帶有部分Linker的Linker-VL片段。PCR 擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。每輪PCR后，將3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混勻，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并借助凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物VH-Linker和Linker-VL。然后，通過重疊延伸PCR法(gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)構(gòu)建scFv-2C10基因，SOE-PCR分兩步：第一步，以上述回收的產(chǎn)物VH-Linker和Linker-VL為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，將VH 和VL 通過Linker連接合成一條單鏈。PCR擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。經(jīng)0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產(chǎn)物。第二步，以第一步純化產(chǎn)物為模板，以引物1和引物4為引物，PCR擴(kuò)增scFv-2C10基因。PCR 擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR產(chǎn)物scFv-2C10。根據(jù)所用引物的不同，最后獲得兩種不同的PCR產(chǎn)物，即為NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的構(gòu)建和鑒定

pelB信號(hào)肽可以引導(dǎo)蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，為了方便后續(xù)的蛋白純化工作，現(xiàn)將pET-22b載體上的pelB信號(hào)肽序列克隆到最終使用載體pET-30a上，方法分為兩步，首先將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產(chǎn)物NcoⅠ-scFv-2C10-XhoⅠ和質(zhì)粒pET-22b均采用限制性內(nèi)切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pET-22b進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

然后提取上述陽性克隆子pET-22b-scFv-2C10的質(zhì)粒，純化后將重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10和質(zhì)粒pET-30a分別用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將pelB-scFv-2C10和pET-30a進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性轉(zhuǎn)化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測(cè)序。

測(cè)序正確的陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，將空載體pET-30a和所提取質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的表達(dá)及鑒定

無菌條件下挑取1.2.3中轉(zhuǎn)化成功的單菌落轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)-pET-30a和BL21(DE3)- pET-30a-pelB-scFv-2C10，分別培養(yǎng)于100 mL液體LB培養(yǎng)基中(含有100 μL 的50 mg/mL的kana)，于200 r/min 、37℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.8左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其終濃度為1 mmol/L、16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h，多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。收集菌體，進(jìn)行蛋白預(yù)表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。

由于pelB信號(hào)肽的存在，所以基本確定目的蛋白主要存在于細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)。又由于只有當(dāng)新生肽鏈的合成速率大于蛋白折疊速率時(shí)，蛋白才會(huì)以包涵體的形式存在，而肽鏈的合成速率又與溫度有著直接的關(guān)系，所以我們選擇16℃低溫誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)可以有效地避免包涵體形式的形成，且實(shí)驗(yàn)證明的確如此。

采用SDS-PAGE對(duì)scFv-2C10的預(yù)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析，將破碎后的菌體細(xì)胞4℃低溫離心，可溶性蛋白經(jīng)鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸6 min直接上樣，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后，接著轉(zhuǎn)印PVDF膜，再以5%牛奶封阻PVDF膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶標(biāo)二抗孵育后，利用ECL顯色液顯色，觀察結(jié)果。

1.2.4 重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv的構(gòu)建和鑒定

將“1.2.1” 中第二步獲得的PCR產(chǎn)物XbalⅠ-scFv-2C10-EcoRⅠ和質(zhì)粒pPICZαA均采用限制性內(nèi)切核酸酶XbalⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA連接酶將scFv-2C10和pPICZαA進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv-2C10，并轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性轉(zhuǎn)化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞制備

1)挑取畢赤酵母GS115單菌落于5 mL液體YPD 培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min活化培養(yǎng)16 h;

2)將活化好的1 mL 菌液轉(zhuǎn)接于100 mL的液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、2000 r/min 培養(yǎng)至OD600約于1.2時(shí)，將菌體轉(zhuǎn)入45 mL的離心管中、4200 r/min、4℃離心5 min；

3)棄上清，菌體沉淀用冰冷的無菌蒸餾水重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

4)棄上清，重復(fù)(3)1次；

5)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，4200 r/min、4℃離心5 min；

6)棄上清，重復(fù)(5)1次；

7)棄上清，菌體用1 mol/L冰冷的無菌山梨醇重懸，分裝成80 μL/管，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10質(zhì)粒的線性化

對(duì)空載E.coliTrans5a-pPiczαA菌株和測(cè)序正確的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，用限制性內(nèi)切酶BstXⅠ對(duì)質(zhì)粒E.coliTrans5a-pPiczαA、E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10進(jìn)行線性化酶切，45℃條件下，酶切20 h。以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切結(jié)果，然后回收酶切線性產(chǎn)物E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)回收效果。

1.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母及鑒定

將1.2.3中保存的感受態(tài)細(xì)胞80 μL和10 μg回收的線性化質(zhì)粒(E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10)分別進(jìn)行混勻后，一起加入已經(jīng)預(yù)冷30 min的電轉(zhuǎn)杯中(0.2 cm)，冰上靜置5 min；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Fungi 檔，2000 V進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物迅速加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L無菌山梨醇混勻，將混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到2 mL的EP管中，28℃，200 r/min 孵育2 h；取孵育好的產(chǎn)物200 μL 輕輕涂在固體YPD平板(含有100 μg/mL 的博萊霉素)上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右，挑取菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子命名為GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10。

1.2.8 重組酵母的表達(dá)及鑒定

無菌條件下挑取轉(zhuǎn)化成功的單菌落轉(zhuǎn)化子GS115-pPiczαA和GS115-pPiczαA-scFv-2C10分別轉(zhuǎn)到BMGY培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)至OD600為4左右時(shí)，離心回收菌體并將其重懸于100 mL BMMY培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)平行組，兩組均培養(yǎng)至OD600為1.2左右，200 r/min、28℃條件下加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并且每隔24 h向培養(yǎng)基中再次添加甲醇，并使其終濃度為0.5%，第一小組誘導(dǎo)滿20 h后，收集菌體和上清，進(jìn)行蛋白預(yù)表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。通過第二小組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)滿72 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。

采用SDS-PAGE對(duì)scFv-2C10的預(yù)表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證分析。檢測(cè)結(jié)果表明，上清液中的目的蛋白幾乎不存在，而菌體中的目的蛋白要多得多。所以接著采用Western blot 對(duì)菌體目的蛋白scFv-2C10進(jìn)行驗(yàn)證分析。將破碎后的菌體細(xì)胞經(jīng)鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白采取同1.2.3中同樣的驗(yàn)證方法進(jìn)行初步驗(yàn)證，最后采用ECL顯色液顯色，觀察并分析結(jié)果。

1.2.9 抗AFB1 scFvs-2C10的性質(zhì)分析

以20 mL PBS緩沖溶液懸浮，在冰浴條件下將細(xì)胞超聲破碎(30 min，功率105 W，2 s開啟，2 s關(guān)閉)，4℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鎳柱親和層析純化上清液，純化后所得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE初步驗(yàn)證后，再以間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 檢測(cè)上述兩種表達(dá)載體所表達(dá)的目的蛋白抗 AFB1scFv-2C10的靈敏度，試驗(yàn)中以pET-30a和pPICZαA兩種空載體的表達(dá)為陰性對(duì)照。

用CBS緩沖液稀釋AFB1O-OVA為1 μg/mL包被96孔板過夜，PBST洗滌甩干。每孔加入200 μL封阻液，37℃靜置2 h，甩干封阻液，PBST洗滌甩干。每孔加入90 μL用PBST 稀釋的抗AFB1 scFv-2C10和10 μL以PBS 稀釋的不同濃度的AFB1 溶液(濃度分別為2、8、20、40和60 μg/mL)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗(以PBST 4000倍稀釋)，37℃靜置1 h，甩干液體，PBST洗滌甩干。每孔加底物緩沖液100 μL后，37℃靜置15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，492 nm 測(cè)吸光值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因scFv-2C10擴(kuò)增

以質(zhì)粒pMD19-T-VH-2C10和pMD19-T-VL-2C10分別為模板，經(jīng)SOE-PCR第一步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二步PCR獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物scFv-2C10基因。經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，大小約為750 bp，與理論值一致。回收試劑盒回收scFv-2C10基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的構(gòu)建及鑒定

將pET-30a質(zhì)粒和回收產(chǎn)物pelB-scFv-2C10分別進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTrans5α細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，以引物1和引物4對(duì)其進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖2-A)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論預(yù)期值一致。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒構(gòu)的建成功。

圖1 scFv基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：Trans2K DNA Marker；1：scFv-2C10 gene fragments

將測(cè)序成功的陽性轉(zhuǎn)化子pET-30a-pelB-scFv和空質(zhì)粒pET-30a分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2-B)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖2含目的基因的轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 2 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containg scFv-2C10 gene。B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containg scFv-2C10 gene

2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv的表達(dá)及鑒定

挑取固體LB平板上生長(zhǎng)的陽性菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和法純化表達(dá)蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對(duì)抗AFB1scFv-2C10蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明已成功誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測(cè)定誘導(dǎo)20 h純化后目的蛋白的產(chǎn)率約為34 mg/L。

2.4 重組質(zhì)粒pPiczαA-scFv的構(gòu)建及鑒定

將pPICZαA質(zhì)粒和回收產(chǎn)物scFv-2C10分別進(jìn)行XbalⅠ和EcoRⅠ雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-scFv-2C10。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTrans5α細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，以引物1和引物4對(duì)其進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖4-A)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論預(yù)期值一致。與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

圖3抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 3 SDS-PAGE and Western-blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE分析;B：純化后的抗AFB1scFv-2C10的SDS-PAGE分析;C：抗AFB1scFv-2C10表達(dá)的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

線性化質(zhì)粒E.coliTrans5a-pPiczαA和E.coliTrans5a-pPiczαA-scFv-2C10分別與GS115感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混勻后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，挑取3 d左右的培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖4 B)，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖4 含目的基因的轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 4 PCR results of transformants containing target gene

A：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1、2為different transformants containing scFv-2C10 gene； B：M為Trans5K Plus DNA Marker; 1～10為different transformants containing scFv-2C10 gene

2.5 重組酵母的表達(dá)及鑒定

挑取YPD 平板上生長(zhǎng)的陽性菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和法純化表達(dá)蛋白，采用SDS-PAGE和Western blot 對(duì)抗AFB1scFv-2C10蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。由圖可知，SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明已成功誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為29 ku，與目的蛋白理論值一致。BCA法測(cè)定誘導(dǎo)72 h后純化的目的蛋白的產(chǎn)率約為132 mg/L。

2.6 抗AFB1scFv-2C10的性質(zhì)分析

分別以間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA純化后的scFv-2C10進(jìn)行分析。間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA 表明，AFB1O-OVA包被濃度為1 μg/mL，抗AFB1scFv-2C10的濃度約為0.17 mg/mL時(shí)，OD492約為1.0。在此條件下，以AFB1為競(jìng)爭(zhēng)抗原，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白的靈敏度，并取5個(gè)點(diǎn)以繪制scFv-2C10的間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，由圖6可知，兩種表達(dá)系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10的檢測(cè)靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，結(jié)果表明采用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的目的蛋白scFv-2C10與AFB1的結(jié)合活性較同一種蛋白采用E.coliBL21(DE3)表達(dá)時(shí)要稍有好轉(zhuǎn)，但是仍然沒有達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

圖5 抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig 5 SDS-PAGE and Western-blotanalysis for the expression of anti-AFB1 scFv-2C10

A：抗AFB1 scFv-2C10表達(dá)的SDS-PAGE和Western-blot分析；B：純化后的抗AFB1 scFv-2C10的SDS-PAGE分析；C：抗AFB1 scFv-2C10 表達(dá)的Western-blot分析。M：Marker；1：purified scFv-2C10

3 討論

基于AFB1的毒性，其檢測(cè)的極限尤為重要。目前的檢測(cè)分析方法中使用較廣的是酶聯(lián)免疫吸附法，該法以檢測(cè)快速、靈敏、樣品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。在該檢測(cè)方法中，抗體是核心試劑，以實(shí)驗(yàn)室保存的抗AFB1單克隆雜交瘤細(xì)胞株為原料構(gòu)建scFv 基因。

目前，對(duì)于外源蛋白的表達(dá)，E.coli表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用較多、研究較多的，也最具有代表性的，E.coli作為AFB1scFv的表達(dá)系統(tǒng)，E.coli具有操作方便快速、實(shí)驗(yàn)周期不長(zhǎng)、生產(chǎn)成本小等優(yōu)點(diǎn)。但其不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的翻譯后修飾( 如二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊等)，存在一定局限性。而真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾機(jī)制接近天然形式。

圖6 scFv-2C10的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制曲線Fig 6 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelB-scFv (A) and pPICZαA-scFv (B)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)又稱甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，是因?yàn)楫叧嘟湍钢械拇佳趸窤OX1基因，在當(dāng)甲醇作為碳源時(shí)，醇氧化酶可以將甲醇轉(zhuǎn)化為醛類物質(zhì)，進(jìn)而再在其他酶類的作用下，轉(zhuǎn)化成酵母所需要的能量，以供酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)線性化的重組質(zhì)粒在5′AOX1和3′AOX1之間和宿主菌的基因組發(fā)生同源重組時(shí)，就成功地獲得了整合基因組的轉(zhuǎn)化子?？刂拼佳趸皋D(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(PAOX1)是強(qiáng)啟動(dòng)子，當(dāng)培養(yǎng)液中加入甲醇時(shí)，PAOX1可以更高效啟動(dòng)醇氧化酶的轉(zhuǎn)錄，而目的基因也正好處于其中，所以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白的產(chǎn)量較高。又由于它是真核表達(dá)系統(tǒng)，所以外源蛋白在構(gòu)象上折疊的更成熟。

pelB信號(hào)肽可以引導(dǎo)目的蛋白在細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)表達(dá)，并且采取一定的手段可以避免包涵體的形成，增加可溶蛋白的表達(dá)，提高純化效率[18]?；诖?，實(shí)驗(yàn)先將目的基因克隆到帶有pelB信號(hào)肽的載體pET-22b上，再將pET-22b上的pelB信號(hào)肽序列和目的基因序列一同克隆到載體pET-30a上，這樣是為了充分利用pelB信號(hào)肽的上述特性?；诖耍瑢?shí)驗(yàn)還將目的基因采用了畢赤酵母表達(dá)體系進(jìn)行蛋白表達(dá)以與E.coli表達(dá)體系相比較。最終本研究成功構(gòu)建了兩種重組載體pET-30a-pelB-scFv-2C10和pPiczαA-scFv，并將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)，以期望scFv的親和力和蛋白表達(dá)量能有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得的目的蛋白的最高表達(dá)量132 mg/L是E.coli表達(dá)系統(tǒng)中蛋白最高表達(dá)量的4倍。經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種表達(dá)系統(tǒng)得到的目的蛋白scFv-2C10均顯示出較好的活性，經(jīng)檢測(cè)，靈敏度分別約為40 μg/mL和35 μg/mL，這說明在酵母表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的活性得到了一定的提高，原因可能是scFv得到了較為充分的折疊和翻譯后修飾。但是距離預(yù)期目標(biāo)仍有較大的差距，接下來的實(shí)驗(yàn)還需要大量的分析和改進(jìn)，分析其原因可能是因?yàn)閟cFv的自身編碼基因的親和力不夠高，所以在未來的實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)采取基因工程技術(shù)手段，如基因定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變等對(duì)scFv的親和力進(jìn)行提高。

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