熊玉琴， 楊 銳， 楊華田， 孫曉曉

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

藻類是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的生產(chǎn)者，它們?cè)谏L(zhǎng)過(guò)程中向環(huán)境釋放大量有機(jī)質(zhì)，并在特定條件下分泌維生素、酶和毒素，在藻體周圍形成一種獨(dú)特的微環(huán)境，被定義為“藻際微環(huán)境”(Phycosphere)[1]。細(xì)菌是海洋環(huán)境重要的分解者，通過(guò)一系列的代謝活動(dòng)參與藻際微環(huán)境中多種物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化過(guò)程，是藻類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提供者與加工者；同時(shí)細(xì)菌還通過(guò)產(chǎn)生或分泌對(duì)藻類有益的代謝物質(zhì)或胞外物，從而促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)[2]，影響著藻類的種類和生理狀態(tài)[3]。

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)[4]是產(chǎn)量最高的紫菜栽培種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)、藥用及生態(tài)價(jià)值，已經(jīng)成為最有價(jià)值的人工栽培海藻之一。近年來(lái)，由于紫菜人工栽培范圍的不斷擴(kuò)大，工業(yè)發(fā)展以及氣候變化等因素的影響，海區(qū)環(huán)境日益惡化，每年都有不同程度的紫菜病害發(fā)生。紫菜病爛是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的問(wèn)題，許多專家從引起紫菜病爛的病原菌入手，如引起條斑紫菜絲狀體黃斑病的河豚毒素交替假單胞菌[5]、條斑紫菜綠變病檸檬假交替單胞菌及壇紫菜葉狀體紅爛病的細(xì)菌[6-7]等。雖然發(fā)現(xiàn)了病害的單一致病菌，但無(wú)法確定所識(shí)別的致病菌是否為唯一的病原菌，而且無(wú)法明確同屬不同種間是否表現(xiàn)出致病性與益生性的差異[8]。這說(shuō)明藻際微生物的功能可能受到其他因素的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)藻類產(chǎn)生影響。因此，近期研究開(kāi)始關(guān)注藻際微環(huán)境與藻類的生態(tài)關(guān)系，為探索藻類健康養(yǎng)殖提供了新視角。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

Zobell 2216E 海水培養(yǎng)基：酵母粉1 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鐵0.1 g，陳海水定容至1000 mL(pH 7.6～7.8)；營(yíng)養(yǎng)海水：參考文獻(xiàn)[9]的方法。

壇紫菜采集于寧波象山，自然陰干，儲(chǔ)存于-20℃。在無(wú)菌海水中復(fù)蘇24 h，挑選細(xì)長(zhǎng)、顏色呈褐色的葉片，在無(wú)菌海水中用滅菌軟毛刷清洗其表面3次，將清洗好的紫菜葉片放入0.7%KI溶液中浸泡10 min，經(jīng)無(wú)菌海水清洗3遍后，抗生素處理參考文獻(xiàn)[10]的方法。

芽孢桿菌Bacillμssp. WPySW2由本實(shí)驗(yàn)室提供。WPySW2接種于100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min 下活化2～3次。稀釋濃度為1×108cells/mL，低速離心去掉營(yíng)養(yǎng)海水，無(wú)菌海水懸浮，按1∶100比例接入營(yíng)養(yǎng)海水中。

1.2方法

1.2.1 “藻-菌”共培養(yǎng)與純培養(yǎng)

每個(gè)平行含 0.2 g 無(wú)菌處理好的葉狀體，加入到300 mL海水營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行壇紫菜葉狀體與芽孢桿菌(3×108cells/mL)共培養(yǎng)(Ph-B)，光強(qiáng)：50～70 μmoL·photons/m2s1，光周期(L∶D)= 12∶12，溫度為20℃，培養(yǎng)周期3 d，充氣。相同培養(yǎng)條件下，純培養(yǎng)(Ph-C)則不添加細(xì)菌。

1.2.2 芽孢桿菌定植壇紫菜的生物特性觀察

樣品預(yù)處理：將培養(yǎng)3 d的壇紫菜取出，剪成約1～2 mm的正方形，若干片，用現(xiàn)配置的2.5%戊二醛固定后投射電鏡觀察。

1.2.3 酶活測(cè)定

SOD和POD酶液制備：取0.3 g 新鮮藻體，加入0.1 mo/L pH 7.4 PBS 緩沖液，制備成10%勻漿液，然后在4℃下4000 r/min離心10 min，上清即用于酶活力測(cè)定。SOD和POD、使用試劑盒(南京建成)測(cè)定。

1.2.4 光合色素測(cè)定

藻膽蛋白(Phy)含量測(cè)定參考高洪峰[11]的方法，略有改動(dòng)。精確稱取0.02 g 藻體3份，液氮研磨，加入2 mL PBS 緩沖液，放入冰箱冷凍(-20℃)，室溫解后離心(12 000 r/min，4℃)20 min，上清即為藻膽蛋白粗提液，分別于565、615、650 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。計(jì)算公式為：

CRPE=0.123A565-0.068A615+0.015A650

(1)

CRPC=0.162A615-0.001A565-0.098A650

(2)

CAPC=0.171A650-0.006A565-0.004A615

(3)

式中，CRPE、CRPC、CAPC分別為R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的含量。

葉綠素a：測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]的方法。

公式：Ca=13.95OD665-6.88OD649，Ca—葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.5 可溶性蛋白測(cè)定

可溶性蛋白含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]的方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣測(cè)定，略有改動(dòng)。精確稱0.1 g鮮藻，加入1 mL緩沖液，冰上機(jī)械勻漿，4000 r/min，離心10 min (4℃)，上清即為待測(cè)蛋白溶液。

公式：樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[μg/g(FW)]=(C×V)/W，C—查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得樣品測(cè)定管中蛋白質(zhì)的濃度(μg/mL)，V—樣品提取液的總體積，W—樣品鮮重。

1.2.6 游離脯氨酸含量的測(cè)定

游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮方法測(cè)定，參考文獻(xiàn)[13]的方法，略有改動(dòng)。取新鮮藻體吸干表面水分，稱0.1 g，液氮研磨，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，5000 r/min，離心10 min，取上清液用于脯氨酸測(cè)定。

1.2.7 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。0.1 g鮮藻，加入5 mL PBS磨成勻漿液，轉(zhuǎn)移至10 mL試管中，加入5 mL含有0.5%硫代巴比妥酸的10%三氯乙酸，混合液在沸水中加熱10 min，冷去后離心，10 000 r/min，20℃，離心10 min，收集上清，分別測(cè)定450、532和600 nm測(cè)定吸光值。

公式：MDA [μmoL/g(FW)]=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]×Vt/(1000×FW)，Vt—上清體積，F(xiàn)W—樣品鮮重。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2003、Spass 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2結(jié)果與分析

壇紫菜培養(yǎng)至第3天，Ph-C組的壇紫菜葉片細(xì)胞的色素體層和線粒體等結(jié)構(gòu)受到了一定程度的損壞，在細(xì)胞內(nèi)形成了一些空泡(圖1-a)，說(shuō)明在無(wú)菌培養(yǎng)的條件下，壇紫菜生長(zhǎng)狀態(tài)受到了影響。在Ph-B組，細(xì)菌聚集在紫菜邊緣，且壇紫菜色素體層和線粒體的結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯空泡的出現(xiàn)，藻體細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較多(圖1-b)，細(xì)胞代謝旺盛，處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

如圖2-a所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Ph-B組和Ph-C組的POD活性呈先下降后上升的循環(huán)趨勢(shì)，兩組壇紫菜POD活性在12 h和48 h達(dá)到最高，分別為18.16 U/mg和17.38 U/mg。純培養(yǎng)組POD活性在6 h達(dá)到最低為9.33 U/mg，共養(yǎng)組POD活性則在72 h達(dá)到最低為10.13 U/mg。兩組壇紫菜葉狀體POD活性在72 h之內(nèi)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。如圖2-b所示，共養(yǎng)組SOD活性呈逐漸下降的趨勢(shì)，對(duì)照組則呈下降后又上升，其后逐漸下降的走勢(shì)，共養(yǎng)組和對(duì)照組在6 h有顯著性差異(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)兩組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 壇紫菜的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)(a：Ph-C; b：Ph-B)

圖2 芽孢桿菌對(duì)壇紫菜酶活力的影響

a：POD; b：SOD

圖3-a 表示Ph-B組和Ph-C組Chla含量總體高于培養(yǎng)前期。Ph-B組在12 h含量最高為14.85 mg/L，Ph-C組在72 h含量最高為11.96 μg /L，Ph-B組在48 h顯著高于Ph-C組(P< 0.05)。藻膽蛋白是壇紫菜的主要光合色素，其品質(zhì)的好壞取決于藻膽蛋白含量的高低[14]，圖3-b、c、d表示在6、12、24、48和72 h中，壇紫菜葉狀體在加入附生菌后(Ph-B)，其含量均顯著高于Ph-C(P<0.05)，且48 h各藻膽蛋白R(shí)PE為6.46 mg/g、RPC 3.6 mg/g和APC 2.28 mg/g含量均達(dá)到最高，而Ph-C組藻膽蛋白最高含量RPE 3.59 mg/g、RPC 1.99 mg/g和APC 1.15 mg/g。Ph-B組的藻膽蛋白含量均高于培養(yǎng)前(0 h)，在6 h和12 h的Ph-C組RPE含量均低于0 h的含量，12 h時(shí)RPC和APC低于起始時(shí)間的含量，總體Ph-C組呈現(xiàn)下降又上升的趨勢(shì)。

圖3 芽孢桿菌對(duì)壇紫菜色素的影響

a：Chla；b：RPC；c：APC；d：RPE

總蛋白含量是評(píng)價(jià)紫菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[14]。由圖4可知，Ph-B組和Ph-C組壇紫菜葉狀體總蛋白含量大體呈上升趨勢(shì)，在有附生菌存在的情況下，總蛋白含量在12、48和72 h均顯著高于Ph-C組(P<0.05)，Ph-B組含量高達(dá)36 mg/g，Ph-C組則為28 mg/g。

圖4 芽孢桿菌對(duì)壇紫菜總蛋白的影響

正常生長(zhǎng)條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量很低， 但當(dāng)其處于逆境脅迫時(shí)含量可迅速增加, 通常情況下脯氨酸累積含量與植物的抗逆性呈正比關(guān)系[15]。藻體沒(méi)有附生菌時(shí)，在6 h、12 h、48 h和72 h時(shí)，Ph-C組游離脯氨酸含量顯著高于Ph-B組(P<0.05)，兩組脯氨酸含量均在12 h分別達(dá)到最大為81.41.26 μg/g和100.93 μg/g，但培養(yǎng)24 h時(shí)，兩組并無(wú)顯著性差異(P> 0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，兩組脯氨酸含量均高于培養(yǎng)前(圖5)。

圖5 芽孢桿菌對(duì)壇紫菜游離脯氨酸的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，其含量可以衡量細(xì)胞膜脂損傷程度[15]。在適溫(20℃)條件下，Ph-B組和Ph-C組MDA含量發(fā)生了極顯著變化(P<0.01，圖6)，且Ph-B組在不同時(shí)間(12、24和72 h)水平下MDA含量均極顯著高于Ph-C組(P<0.01)，Ph-C組MDA含量在6和48 h時(shí)極顯著高于Ph-B組(P< 0.01)，其值高達(dá)209.53 nmoL/g。

圖6 芽孢桿菌對(duì)壇紫菜丙二醛的影響

3 討論

在適宜溫度下，海洋芽孢桿菌Bacillus有利于壇紫菜的生長(zhǎng)，促進(jìn)了藻體內(nèi)總蛋白的積累，與壇紫菜形成互利共生的關(guān)系。植物體內(nèi)SOD和POD活性的提高能增強(qiáng)植物對(duì)多種氧化脅迫的抗性。在本研究中，在20℃培養(yǎng)條件下，Ph-B和Ph-C的SOD和POD并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這說(shuō)明在適宜溫度下，壇紫菜葉狀體與細(xì)菌共培養(yǎng)并未對(duì)壇紫菜造成脅迫。作為衡量細(xì)胞膜脂損傷程度重要指標(biāo)的MDA含量在Ph-C中48 h出現(xiàn)極顯著增加現(xiàn)象(P<0.01)，且其含量209.53 μmol/g極高，遠(yuǎn)高于張?jiān)?1℃測(cè)量的耐高溫型與野生型壇紫菜MDA含量20～30 μmol/g[13]，因此無(wú)菌處理對(duì)紫菜細(xì)胞造成了一定的影響。同時(shí)，非酶促系統(tǒng)如脯氨酸等的含量在一定程度上可以判斷逆境對(duì)植物的危害程度和植物對(duì)逆境的抵抗力。在本研究中，紫菜葉狀體在與共附生菌共同培養(yǎng)條件下(Ph-B)，脯氨酸含量顯著低于Ph-C的壇紫菜(P<0.05)，符合壇紫菜代謝組測(cè)定的結(jié)果。在復(fù)雜的藻際微環(huán)境中，沒(méi)有了生物膜這層保護(hù)系統(tǒng)[16]，藻細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量隨即顯著上升，而到了培養(yǎng)后期，隨著細(xì)胞內(nèi)SOD含量的下降，脯氨酸含量也開(kāi)始顯著下降(圖5)，說(shuō)明脯氨酸在壇紫菜清除自由基以避免細(xì)胞損傷中也發(fā)揮了重要作用。

20℃下菌藻共培養(yǎng)，促進(jìn)了紫菜生長(zhǎng)，增加了光合色素的含量。藻膽蛋白和葉綠素Chl a是壇紫菜主要的光合色素。其中，藻膽蛋白被認(rèn)為是藻類細(xì)胞中的主要氮源貯藏庫(kù)，在適宜的光照和溫度培養(yǎng)條件下，豐富的氮源有利于藻膽蛋白的合成，相反，在缺乏氮源的情況下，藻膽蛋白的合成明顯降低甚至停止[14]。有研究證實(shí)浮游生物硅藻Pseudonitzschiamultiseries優(yōu)先利用的N源是來(lái)自細(xì)菌Sulfitobacter(SA11)衍生的銨而不是外援添加的硝酸鹽[17]。本課題組前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：濃度為1.0×10-8～1.0×10-6mg/mL的附生真菌Cladosporiumsp.提取物N5能促進(jìn)壇紫菜葉狀體和絲狀體的生長(zhǎng)以及藻膽蛋白的積累[9]。我們前期試驗(yàn)表明芽孢桿菌WPySW2對(duì)壇紫菜葉狀體起到類似植物生長(zhǎng)激素的作用，促進(jìn)其生長(zhǎng)，與在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。微藻中也報(bào)道過(guò)類似結(jié)果，微藻利用細(xì)菌產(chǎn)生的吲哚-3-乙酸、維生素B12來(lái)促進(jìn)自身生物量的增加[18]。細(xì)菌Bacillussp. WPySW2 是通過(guò)產(chǎn)生類似生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)還是通過(guò)為共養(yǎng)組壇紫菜提供氮源而促進(jìn)了壇紫菜的生長(zhǎng)，有待進(jìn)一步探究。

相同溫度下，我們用核磁研究了芽孢桿菌胞內(nèi)代謝物，發(fā)現(xiàn)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、核糖5-磷酸、尿嘧啶，還有乙酰胺、琥珀酸、甜菜堿含量顯著升高(未發(fā)表)。有研究表明，玫瑰桿菌對(duì)DOM、硫化物、脲、胺、?；撬帷⑻鸩藟A和磷酸酯等化合物的利用，是為了與藻細(xì)胞維持的共生關(guān)系[3]?；蛟S，芽孢桿菌在維持穩(wěn)定的藻際環(huán)境中，有類似玫瑰桿菌的生態(tài)功能。但是，芽孢桿菌到底是通過(guò)哪種或哪類代謝物影響了壇紫菜的生理特征，二者之間如何進(jìn)行信號(hào)物質(zhì)的傳遞，有待深入研究。

壇紫菜的養(yǎng)殖和病害防治已經(jīng)成為如今的一項(xiàng)熱門研究，芽孢桿菌作為壇紫菜的藻際附生菌，通過(guò)研究芽孢桿菌對(duì)壇紫菜生長(zhǎng)、光合作用的影響，分析其中的規(guī)律，可以很好地指導(dǎo)在養(yǎng)殖業(yè)中利用芽孢桿菌進(jìn)行壇紫菜的健康養(yǎng)殖。在適宜溫度下芽孢桿菌對(duì)壇紫菜的生理特性影響的研究中，由此得出結(jié)論：在適宜溫度(20℃)下，芽孢桿菌能促進(jìn)壇紫菜的生長(zhǎng)和光合作用，附生菌能為藻體提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為穩(wěn)定的藻際環(huán)境提供必要條件。但是，不同環(huán)境下的藻際細(xì)菌的生態(tài)功能，有待進(jìn)一步研究。

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