鄭曉筠， 黃浩輝， 何 杰， 李瑜元， 聶玉強(qiáng)， 杜艷蕾， 周永健

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院 廣州消化疾病中心，廣東 廣州 510180

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為我國(guó)僅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病，呈持續(xù)升高態(tài)勢(shì)[1]。二次打擊學(xué)說(shuō)是NAFLD發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說(shuō)，強(qiáng)調(diào)脂質(zhì)代謝紊亂所導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。近幾年多次打擊學(xué)說(shuō)認(rèn)為，基因多態(tài)性及基因受體等在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，NAFLD認(rèn)為是一種遺傳代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病[3]。miRNA是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的小RNA，miRNA是基因表達(dá)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其調(diào)節(jié)涉及肝臟中的脂質(zhì)體內(nèi)平衡、炎癥等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。最近研究[5]發(fā)現(xiàn)，miR-22與糖尿病、心血管疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)，但與脂肪肝等代謝性疾病關(guān)系的研究較為欠缺。沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirtuin type 1, SIRT1)是依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，參與糖代謝、胰島素分泌等多條代謝通路，對(duì)代謝綜合征等發(fā)揮重要的作用，被證明與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[6]。因此，本文通過(guò)研究miR-22在L02人細(xì)胞脂肪肝模型中的變化，探討其對(duì)NAFLD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株正常肝細(xì)胞株L02購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，于質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2試劑油酸(Oleic acid)、棕櫚酸(Palmitic acid minimum 99%)、二甲基亞砜(DMSO)、油紅O(Oil Red O)均購(gòu)自Sigma公司；三酰甘油、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine?2000購(gòu)自上海英濰捷基貿(mào)易有限公司；Trizol提取RNA試劑盒購(gòu)自Takara公司；染料法Hairpinit miRNAs定量和U6校準(zhǔn)qRT-PCR試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-22 mimic和miR-22 inhibitor由廣州市銳博生物科技有限公司合成；SIRT1人抗鼠抗體、羊抗鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3主要設(shè)備和材料倒置顯微鏡(OLYMPUS)，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo)，熒光定量PCR儀 qTower2.2(德國(guó)耶拿)、S1000 PCR儀(Bio-rad)、酶標(biāo)儀(BIOTEK)等。

1.4構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪變性模型將L02細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合率為70%～80%，每孔更換質(zhì)量濃度為0.5 mmol/L軟脂酸和油酸混合液(2∶1)FFA和質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS的DMEM培養(yǎng)液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h成為細(xì)胞脂肪肝模型。

1.5實(shí)驗(yàn)分組L02細(xì)胞株培養(yǎng)后分為mimic NC組、miR-22 mimic組、inhibitor NC組和miR-22 inhibitor組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔70%密度在6孔板鋪同等數(shù)量細(xì)胞；于無(wú)菌EP管內(nèi)，將5 μl Lipofectamine?2000與245 μl opti-MEM培養(yǎng)物在25 ℃混勻5 min，另一無(wú)菌EP管，10 μl miR-22 mimic/miR-22 inhibitor或轉(zhuǎn)染對(duì)照物與245 μl opti-MEM培養(yǎng)物稀釋?zhuān)瑢烧呋旌显?5 ℃放置15 min，以每孔500 μl加入相應(yīng)的6孔板中；6 h后棄液，更換質(zhì)量濃度為0.5 mmol/L的FFA和質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)置2個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6油紅O染色及油紅含量測(cè)定用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，質(zhì)量濃度為5 g/L的油紅O避光染色60 min，洗滌干凈后在顯微鏡下觀察脂滴情況；使用異丙醇脫色，吸入96孔板，每孔100 μl，在酶標(biāo)儀中讀取510 nm處的吸光度。

1.7甘油三脂及肝酶含量測(cè)定經(jīng)胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞裂解后收集上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG、GPT、GOT的含量。

1.8miR-22的表達(dá)水平檢測(cè)參照TaKaRa試劑說(shuō)明書(shū)，用Trizol試劑提取上述各組細(xì)胞的RNA；按照Hairpin-it miRNAs定量試劑盒上說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再在熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。把U6作為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示待測(cè)組中miR-22相對(duì)于對(duì)照組中表達(dá)水平的表達(dá)倍數(shù)，其中ΔΔCt=待測(cè)組樣本的ΔCt-對(duì)照組樣本ΔCt，ΔCt=目的miR-22 Ct值-內(nèi)參U6 Ct值。

1.9生物信息學(xué)分析通過(guò)TargetScan、MiRanda、Mirdb靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)作生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)miR-22的靶基因，結(jié)合文獻(xiàn)篩選出預(yù)計(jì)與NAFLD相關(guān)的基因。TargetScan網(wǎng)址http://www.targetscan.org/vert-71/；MiRanda網(wǎng)址http://www.microrna.org/；Mirdb網(wǎng)址http://www.mirdb.org/miRDB。

1.10Westernblotting檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)細(xì)胞裂解后，蛋白定量；調(diào)節(jié)電壓為110 V，SDS-PAGE電泳約2 h；調(diào)節(jié)恒流為350 mA濕轉(zhuǎn)膜約1 h；BSA封閉1 h；一抗SIRT1人抗鼠抗體4 ℃搖床過(guò)夜孵育；二抗山羊抗兔抗體，常溫孵育1 h；曝光、顯影后，軟件分析光密度值，以目的基因/β-actin帶的密度比值表示目的基因蛋白表達(dá)水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的兩組等方差數(shù)據(jù)間，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建L02人脂肪肝細(xì)胞模型經(jīng)油紅O染色后，正常組的肝細(xì)胞略呈紡錘形，細(xì)胞邊緣清晰，核膜完整，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴；模型組的脂肪變肝細(xì)胞略變圓，可見(jiàn)散在紅色脂滴位于細(xì)胞膜的側(cè)邊緣，或呈環(huán)狀位于胞內(nèi)(見(jiàn)圖1A)。細(xì)胞油紅O染色及脫色后，模型組油紅脫色含量與正常組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明模型組脂滴顯著比正常組多(見(jiàn)圖1B)。模型組中TG含量比正常組顯著增加，AST/ALT顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，符合脂肪肝肝功能表現(xiàn)；ALT、AST差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該構(gòu)建脂肪肝模型方法未對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷，表明模型組構(gòu)建脂肪肝模型成功，脂肪變明顯(見(jiàn)圖1C～1E)。

注：a：正常組正常細(xì)胞；b：模型組脂肪變細(xì)胞。*P<0.05，#P>0.05。

2.2脂肪變細(xì)胞模型miR-22表達(dá)顯著增加成功建立脂肪細(xì)胞肝模型后，提取正常組和模型組細(xì)胞RNA，使用PCR檢測(cè)miR-22的表達(dá)量。正常組miR-22 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.551±0.1525，模型組miR-22 mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.221±0.1834，模型組miR-22 mRNA的表達(dá)量與正常組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0126)(見(jiàn)圖2)。

注：*P<0.05。圖2 L02人肝正常細(xì)胞和脂肪變細(xì)胞miR-22 mRNA表達(dá)量Fig 2 The expression of miR-22 mRNA in L02 normal hepaticcells and steatosis cells

2.3miR-22促進(jìn)人脂肪肝細(xì)胞的脂肪沉積分別轉(zhuǎn)染miR-22 mimic和miR-22 inhibitor，過(guò)表達(dá)miR-22和抑制miR-22后再建立脂肪變性細(xì)胞模型，油紅O染色可見(jiàn)，與mimic NC組相比，miR-22 mimic組脂滴顯著增加，脂滴變大，胞內(nèi)較多深染的脂滴呈抱團(tuán)狀；與inhibitor NC組相比，miR-22 inhibitor組脂滴相對(duì)減少，脂滴染色變淺，胞內(nèi)未見(jiàn)明顯深染的抱團(tuán)脂滴(見(jiàn)圖3A)。細(xì)胞油紅O染色脫色后，miR-22 mimic組油紅脫色含量比mimic NC組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0034)；miR-22 inhibitor組油紅脫色含量與inhibitor NC組相比呈減少趨勢(shì)(P=0.0847)，miR-22 mimic組與miR-22 inhibitor組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-22后誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞模型脂滴顯著增加，抑制miR-22后誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞模型脂滴顯著減少(見(jiàn)圖3B)。miR-22 mimic組TG含量和AST/ALT與mimic NC組比較均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-22 inhibitor組中TG含量比inhibitor NC組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0445)，AST/ALT值與inhibitor NC組相比呈減少趨勢(shì)(P=0.8385)(見(jiàn)圖3C～3E)。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-22后誘導(dǎo)的人脂肪肝細(xì)胞脂肪沉積加重，抑制miR-22后誘導(dǎo)的人脂肪肝細(xì)胞脂肪沉積減輕。

注：*P<0.05,#P>0.05。

圖3過(guò)表達(dá)miR-22和抑制miR-22及其對(duì)照組的肝脂肪變細(xì)胞模型相關(guān)檢測(cè)結(jié)果A：油紅O染色(200×)；B：油紅O染色脫色油紅含量測(cè)定；C：TG含量；D：AST/ALT比值；E：ALT和AST含量

Fig3RelevanttestresultsoftransfectedmiR-22mimicandmiR-22inhibitorintoL02humansteatotichepatocytesanditscontrolgroupA: oil red O staining (200×); B: determination of oil red decolorization by oil red O staining; C: the content of TG; D: the ratio of AST/ALT; E: the content of ALT and AST

2.4脂肪變細(xì)胞模型SIRT1蛋白表達(dá)顯著減少成功建立脂肪細(xì)胞肝模型后，檢測(cè)正常組和模型組的SIRT1蛋白表達(dá)，灰度值掃描后統(tǒng)計(jì)分析。模型組脂肪肝細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)量與正常組比較顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0249,見(jiàn)圖4)。

注：*P<0.05。

圖4正常組和模型組的SIRT1蛋白表達(dá)A：SIRT1 Western blotting曝光圖像；B：SIRT1蛋白表達(dá)灰度值分析

Fig4TheexpressionsofSIRT1proteininL02humansteatotichepatocytemodelandcontrolgroupA: SIRT1 Western blotting exposure images; B: the gray value analysis of SIRT1 protein expression

2.5miR-22負(fù)調(diào)控SIRT1促進(jìn)脂肪肝細(xì)胞脂肪沉積使用TargetScan、MiRanda、Mirdb預(yù)測(cè)miR-22的靶基因發(fā)現(xiàn)，SIRT1是miR-22的靶基因(見(jiàn)圖5)。分別轉(zhuǎn)染miR-22 mimic和miR-22 inhibitor，過(guò)表達(dá)miR-22和抑制miR-22后再建立脂肪變性細(xì)胞模型，Western blotting檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)，灰度值掃描后統(tǒng)計(jì)分析，在正常細(xì)胞和脂肪變肝細(xì)胞中，miR-22 mimic組SIRT1蛋白表達(dá)量比mimic NC組顯著降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-22后，SIRT1的表達(dá)量減少，提示miR-22負(fù)調(diào)控SIRT1。

在正常細(xì)胞中，miR-22 inhibitor組SIRT1蛋白表達(dá)量與inhibitor NC組相比呈增加趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0801)；在脂肪肝細(xì)胞中，miR-22 inhibitor組SIRT1蛋白表達(dá)量與inhibitor NC組比較呈增加趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0674)(見(jiàn)圖6A～6B)，結(jié)果顯示，抑制miR-22后，SIRT1的表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，與過(guò)表達(dá)miR-22時(shí)趨勢(shì)相一致。

圖5 TargetScan、Microrna、Mirdb網(wǎng)站預(yù)測(cè)SIRT1是miR-22的靶基因Fig 5 TargetScan, Microrna and Mirdb sites predicted that SIRT1 was the target gene of the miR-22

注：*P<0.05,#P>0.05。

圖6過(guò)表達(dá)miR-22和抑制miR-22及其對(duì)照組的SIRT1蛋白表達(dá)A：SIRT1 Western blotting曝光圖像；B：SIRT1蛋白表達(dá)的灰度值分析

Fig6TheexpressionofSIRT1proteinoftransfectedmiR-22mimicandmiR-22inhibitorintoL02humansteatotichepatocytesanditscontrolgroupA: SIRT1 Western blotting exposure images; B: the gray value analysis of SIRT1 protein expression

3 討論

NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未明確,近來(lái)不少研究[7]發(fā)現(xiàn)，miRNA與NAFLD進(jìn)展有關(guān)，預(yù)計(jì)miRNA對(duì)NAFLD的篩查、疾病分期和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展及疾病的治療均有重要意義，但具體何種miRNA參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及如何作用尚未完全了解?，F(xiàn)有研究[8]提示，miR-22表達(dá)與肝臟腫瘤發(fā)生具有負(fù)相關(guān)性。SIRT1下調(diào)會(huì)使部分脂肪生成和糖異生相關(guān)基因的表達(dá)改變，如下調(diào)PPARα信號(hào)并降低脂肪酸β-氧化，且會(huì)誘導(dǎo)局部炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島素抵抗，SIRT1通過(guò)參與脂質(zhì)和碳水化合物代謝的調(diào)節(jié)在NAFLD的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，初步探討肝細(xì)胞脂肪變時(shí)miR-22的表達(dá)變化及其促進(jìn)脂肪沉積的機(jī)制，SIRT1是miR-22預(yù)測(cè)的靶基因，研究結(jié)果顯示，miR-22在肝細(xì)胞脂肪變時(shí)表達(dá)顯著增加，miR-22可能通過(guò)表達(dá)上調(diào)負(fù)調(diào)控SIRT1表達(dá)從而促進(jìn)脂肪沉積。

本實(shí)驗(yàn)使用正常人肝細(xì)胞株L02脂肪變性細(xì)胞模型能較好地模擬NAFLD病變過(guò)程中的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，較廣泛地應(yīng)用在研究當(dāng)中[10]。油紅O染色及油紅脫色含量測(cè)定能較好地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況，同時(shí)TG含量和AST/ALT能較好地反映脂肪肝變性的嚴(yán)重程度[11]。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-22對(duì)肝細(xì)胞脂肪變的作用，過(guò)表達(dá)miR-22和抑制miR-22后建立脂肪變性細(xì)胞模型，結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-22檢測(cè)結(jié)果均提示脂肪變程度顯著加重，抑制miR-22后部分檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮miR-22在細(xì)胞中原表達(dá)量較低，抑制后對(duì)脂肪沉積的作用較輕微，但總體趨勢(shì)一致，說(shuō)明miR-22參與脂肪肝的脂肪沉積。SIRT1在脂肪肝中表達(dá)變少，其結(jié)果與其他文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，過(guò)表達(dá)miR-22后，SIRT1蛋白表達(dá)顯著減少，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果考慮miR-22負(fù)調(diào)控SIRT1表達(dá)從而促進(jìn)脂肪沉積，miR-22可能成為脂肪肝新的檢測(cè)方向和治療靶標(biāo)。

本研究探討并驗(yàn)證了miR-22在脂肪沉積過(guò)程中的作用，并初步探討了miR-22表達(dá)上調(diào)負(fù)調(diào)控SIRT1促進(jìn)脂肪沉積的機(jī)制。我們前期實(shí)驗(yàn)[13]已經(jīng)在體內(nèi)驗(yàn)證了FXR基因與NAFLD密切相關(guān)，同時(shí)有實(shí)驗(yàn)[8]表明，miR-22與FXR密切相關(guān)，但缺乏直接驗(yàn)證靶基因的實(shí)驗(yàn)，因此，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-22的靶基因，深入探討miR-22上下游基因及與FXR相關(guān)通路促進(jìn)NAFLD的機(jī)制。此外，細(xì)胞模型存在局限性，將在人體NAFLD組織或動(dòng)物模型上進(jìn)一步確定miR-22對(duì)NAFLD的作用。

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