張汝鋼， 張修禮， 楊云生

1.解放軍總醫(yī)院海南分院消化科，海南 三亞 572013； 2.解放軍總醫(yī)院消化科

金黃色葡萄球菌(S.aureus)，簡稱金葡菌。它能夠分泌多種外毒素，其中的凝固酶、葡萄球菌溶素(溶血酶)和耐熱核酸酶是最重要的外毒素[1-3]。凝固酶(coagulase)耐熱能使菌體包被纖維蛋白而抗拒調(diào)理作用和吞噬。溶血酶(staphylolysin)不耐熱，其中溶血酶α(hla)最重要，對多種哺乳動物的紅細胞有溶血作用。耐熱核酸酶(thermostable nuclease)，能較強地降解DNA和RNA，利于細菌擴散，目前臨床上已將其作為測定葡萄球菌有無致病性的重要指標之一。金葡菌能夠引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫[4-5]，但哪種外毒素起關(guān)鍵作用目前還不明確，同時外毒素的活性表達是否存在時間上的差異目前也不明確。本研究旨是探討在化膿性肝膿腫的形成過程中金葡菌分泌的哪一種外毒素起關(guān)鍵作用，同時也探討外毒素的活性表達是否存在時間上的差異。

1 材料與方法

1.1材料RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)和RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒購自日本TaKaRa公司。凝固酶(coa)、溶血酶α(hla)、耐熱核酸酶A(nucA)、附加基因調(diào)節(jié)基因A(agrA)和16S rRNA引物由華大基因公司合成。甲苯胺藍DNA酶瓊脂、凝固酶血槳和溶葡球菌酶分別購自英國Sigma-Aldrich公司、美國Remal公司和上海Sangon公司。日本大耳兔由解放軍總醫(yī)院動物中心提供。微孔濾膜(0.45 μm)、抗凝管(K2 EDTA 3.6 mg)和游標卡尺(1107型)分別購自美國Life Sciences公司、美國BD公司和哈爾濱量具刃具廠。

1.2方法

1.2.1 金葡菌生長曲線的描記：挑取生長良好的金葡菌單菌落接種于100 ml LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔2 h取菌液測量OD450吸光度值，共測量9個點。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以菌液OD450吸光度值為縱坐標在平面直角坐標系中作圖[6-7]。實驗重復5次。

1.2.2 金葡菌毒力蛋白mRNA表達：(1)金葡菌總RNA提?。航鹌暇贚B培養(yǎng)基內(nèi)純培養(yǎng)12 h(ATCC 29213)和16 h(ATCC 25923)，取3 ml菌液于4 000×g離心10 min，收集細菌沉淀。加入100 μl溶葡球菌酶(1 U/μl)，混勻，37 ℃水浴中消化15 min。加入1 ml RNAiso Plus，混勻，室溫靜置5 min。RNA提取按試劑盒說明書要求操作，最后用55 μl DEPC水溶解沉淀。取5 μl用紫外可見分光光度計定量。最后將總RNA用DEPC水定量為100 ng/μl，置于4 ℃冰箱備用。

表1 RT-PCR引物序列、基因位點、產(chǎn)物大小、文獻來源和反應條件

1.2.3 金葡菌毒力蛋白活性測定：(1)金葡菌培養(yǎng)液上清和兔紅細胞的制備：挑取生長良好的金葡菌單菌落置于LB培養(yǎng)基內(nèi)純培養(yǎng)12 h、16 h和18 h，菌液4 000×g離心10 min，上清通過0.45 μm微孔濾膜過濾，過濾后的培養(yǎng)液上清置于-80 ℃冰箱保存。采集日本大耳兔空腹耳緣靜脈血2 ml，注入內(nèi)含EDTAK2 3.6 mg的抗凝管，混勻后室溫下2 000 r/min離心10 min，去除血漿和白細胞；用3 ml PBS(0.01 M，pH 7.2～7.4)清洗紅細胞，共清洗4次；紅細胞沉淀用PBS定溶到2 ml，冰上保存。

(2)金葡菌游離耐熱核酸酶活性測定：金葡菌培養(yǎng)液上清在微波爐上煮沸15 min備用。按試劑說明書要求配制甲苯胺藍DNA酶瓊脂(TB-DNA-agar，TDA)兩塊平板，用巴斯德吸管打孔(直徑3 mm)，取培養(yǎng)12 h、16 h和18 h的細菌培養(yǎng)液上清10 μl在一塊平板上點樣，取5 μl、10 μl和15 μl上清在另一塊平板上點樣(ATCC 29213培養(yǎng)12 h，ATCC 25923培養(yǎng)16 h)，37 ℃靜置孵育24 h測量粉紅色暈環(huán)直徑。LB培養(yǎng)基代替細菌培養(yǎng)液上清作陰性對照[9-10]。實驗重復6次。

(3)金葡菌游離凝固酶活性測定：在1.5 ml EP管中加入0.5 ml經(jīng)EDTA抗凝的兔血漿，再加入0.5 ml培養(yǎng)12 h、16 h和18 h的細菌培養(yǎng)液上清，混勻，37 ℃靜置孵育8 h和24 h，倒置EP管觀察血漿凝結(jié)情況。LB培養(yǎng)基代替細菌培養(yǎng)液上清作為陰性對照[11-12]。實驗重復3次。

(4)金葡菌游離溶血酶活性測定：在1.5 ml EP管內(nèi)混勻0.1 ml細菌培養(yǎng)液上清、0.9 ml PBS和25 μl兔紅細胞；37 ℃靜置孵育10 min；5 500×g室溫離心1 min；在紫外可見分光光度儀上測量上清液OD543透過率值。金葡菌游離溶血酶活性為上清OD543透過率值，為相對活性，呈反變關(guān)系。LB培養(yǎng)基代替細菌培養(yǎng)液上清作陰性對照，質(zhì)量濃度為10 g/L的SDS溶液代替細菌培養(yǎng)液上清液作為陽性對照[8，13]。實驗重復6次。

2 結(jié)果

2.1金葡菌生長曲線的描記金葡菌ATCC 29213生長曲線左移，到達指數(shù)生長期的時間為8 h、到達平臺期的時間為10 h；ATCC 25923生長曲線右移，到達指數(shù)生長期的時間為12 h、到達平臺期的時間為14 h；培養(yǎng)18 h兩株細菌均達到平臺期(見圖1)。金葡菌ATCC 25923到達指數(shù)生長期的OD450吸光度值是ATCC 29213的3.778倍。金葡菌ATCC 29213的生長速度顯著快于ATCC 25923(F=14.42，P=0.000)。

圖1 金葡菌生長曲線Fig 1 Growth curves of S.aureus

2.2金葡菌毒力蛋白mRNA表達金葡菌在LB培養(yǎng)基內(nèi)純培養(yǎng)12 h(ATCC 29213)和16 h(ATCC 25923)。ATCC 29213凝固酶和耐熱核酸酶A mRNA表達量顯著高于ATCC 25923(F=63.5，P=0.000vsF=63.5，P=0.000)，ATCC 29213溶血酶α和agrA mRNA表達量與ATCC 25923比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=63.5，P=0.679vsF=63.5，P=0.452)(見圖2)。

圖2 金葡菌毒力蛋白mRNA表達 A：毒力蛋白(coa、hla、nucA)和agrA mRNA表達；B：內(nèi)參照16S RNA mRNA表達Fig 2 Expressions of virulence protein mRNA of S.aureus A: expressions of coa, hla, nucA and agrA mRNA; B: expressions of 16S RNA mRNA

2.3金葡菌毒力因子活性測定

2.3.1 金葡菌游離耐熱核酸酶活性測定：細菌培養(yǎng)液上清10 μl點樣于TDA，37 ℃靜置孵育24 h觀察，ATCC 29213(12 h、16 h和18 h)的粉紅色暈環(huán)直徑顯著小于對應時間的ATCC 25923(12 h、16 h和18 h)(F=68.2，P=0.000)；ATCC 25923 12 h和16 h(P=0.043)、12 h和18 h(P=0.006)之間的粉紅色暈環(huán)直徑大小有顯著性差異，而16 h和18 h之間的粉紅色暈環(huán)直徑大小無顯著性差異(P=0.421)。細菌培養(yǎng)液上清5 μl、10 μl和15 μl(ATCC 29213培養(yǎng)12 h，ATCC 25923培養(yǎng)16 h)點樣于TDA，37 ℃靜置孵育24 h觀察，ATCC 29213培養(yǎng)液上清的粉紅色暈環(huán)直徑顯著小于對應體積的ATCC 25923(F=72.9，P=0.000)。

2.3.2 金葡菌游離凝固酶活性測定：細菌培養(yǎng)液上清和兔血漿混勻，37 ℃靜置孵育。孵育8 h倒置觀察，ATCC 29213(12 h、16 h和18 h)的血漿均凝結(jié)，而ATCC 25923(12 h、16 h和18 h)的血漿仍為水樣；孵育24 h再倒置觀察，ATCC 29213(12 h、16 h和18 h)和ATCC 25923(12 h)的血漿均凝結(jié)，而ATCC 25923(16 h和18 h)的血漿仍為水樣(見圖3)。

注：紅色標記為ATCC 29213，藍色標記為ATCC 25923，無標記為陰性對照。圖3 金葡菌游離凝固酶活性測定 A：37 ℃靜置孵育8 h后倒置觀察；B：37 ℃靜置孵育24 h后倒置觀察Fig 3 Detection of free coagulase activity of S.aureus A: observation after incubation for 8 hours at 37 ℃; B: observation after incubation for 24 hours at 37 ℃

2.3.3 金葡菌游離溶血酶活性測定：細菌培養(yǎng)液上清和兔紅細胞混勻，37 ℃靜置孵育10 min，離心后測量上清液OD543透過率。ATCC 29213(12 h、16 h和18 h)和陰性對照LB透過率顯著高于ATCC 25923(12 h、16 h和18 h)和陽性對照SDS(F=8383，P=0.000)；ATCC 29213(12 h、16 h和18 h)透過率與陰性對照LB之間無顯著性差異(P=0.997)。金葡菌ATCC 25923(12 h)培養(yǎng)液上清和兔紅細胞混勻后未經(jīng)孵育僅部分溶血，而ATCC 25923(16 h和18 h)培養(yǎng)液上清和兔紅細胞混勻后未經(jīng)孵育就能溶血。37 ℃靜置孵育10 min離心后，ATCC 25923(12 h、16 h和18 h)均溶血。

3 討論

前期的研究[4-5]結(jié)果顯示，金葡菌ATCC 29213與自靜脈血凝塊混合后注射能夠引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫，而ATCC 25923則不能。為探討其機制，我們對其生長速度、毒力蛋白mRNA表達和活性高低進行了深入研究。金葡菌ATCC 29213到達指數(shù)生長期和平臺期的時間均早于ATCC 25923，提示前者的生長速度顯著快于后者。這與細菌純培養(yǎng)時前者培養(yǎng)液的混濁時間早于后者相一致，進一步說明前者的生長速度顯著快于后者。

金葡菌凝固酶mRNA表達量與其游離凝固酶活性表達相一致，但耐熱核酸酶A和α溶血酶mRNA表達量與其活性表達不一致。兩株細菌附加基因調(diào)節(jié)基因A(agrA)表達量無顯著性差異，說明我們的RT-PCR結(jié)果是可信的。兩種實驗方法產(chǎn)生的結(jié)果不一致，可能的原因是，細菌毒力實驗是從蛋白質(zhì)水平檢查，檢查的是總的游離溶血酶活性或總的游離耐熱核酸酶活性，而RT-PCR實驗是從mRNA水平檢查，檢查的是溶血酶α或耐熱核酸酶A單一成份的表達。溶血酶和耐熱核酸酶亞型[8-10]的存在可能是這兩種檢查方法結(jié)果不一致的原因。

金葡菌ATCC 29213的游離凝固酶活性高于ATCC 25923。金葡菌ATCC 25923(12 h)的游離凝固酶活性高于ATCC 25923(16 h和18 h)，然而其游離耐熱核酸酶活性和游離溶血酶活性顯著低于ATCC 25923(16 h和18 h)。提示，金葡菌ATCC 25923分泌的毒力蛋白活性表達存在時間上的先后順序。

金葡菌ATCC 29213和自體靜脈血凝塊混合后注入肝實質(zhì)能產(chǎn)生化膿性肝膿腫，而金葡菌ATCC 25923和自體靜脈血凝塊混合后注入肝實質(zhì)不能產(chǎn)生化膿性肝膿腫[4-5]。說明金葡菌ATCC 29213是形成化膿性肝膿腫的關(guān)鍵因素，其原因可能與其生長速度快和分泌的游離凝固酶活性高有關(guān)，而與其分泌的耐熱核酸酶和溶血酶活性表達無關(guān)。

金葡菌ATCC 29213引起巴馬小型豬化膿性肝膿腫的機制與其生長速度快和產(chǎn)生的游離凝固酶活性高有關(guān)；金葡菌分泌的外毒素活性表達可能存在時間上的先后順序。

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