龐艷華， 馬 軍， 趙曉靜， 李雨濛， 李 南， 孫 佳， 袁 翎

1.北京朝陽醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100043； 2.鄭州大學第二附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州大學消化疾病研究所； 3.鄭州大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科； 4.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院放療科

食管癌死亡率位于所有腫瘤的第6位，5年生存率<20%[1]。放療是進展期食管癌主要的治療方法，通過產(chǎn)生自由基使DNA雙鍵斷裂(DSB)，誘導細胞損傷，如果靶細胞不能修復這種類型的損傷，可以直接或間接地導致細胞死亡[2]，而腫瘤細胞在DNA損傷后，常常啟動修復機制，導致治療失敗。DNA雙鍵斷裂有兩條主要的修復通路：非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HRR)，DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)是非同源末端連接的中心因子[3]，在DNA斷裂修復中起著重要作用。

miRNA作為一種內(nèi)源性小單鏈非編碼RNA，能通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯進而調(diào)控靶基因的表達，其參與許多生理性和病理性的進程，包括放射損傷相關(guān)的信號傳導通路[4-5]。本文利用食管鱗癌細胞系EC109，檢測放射照射后miR-101、miR-21、miR-126的變化，并分析它們和DNA-PKcs的關(guān)系，了解食管鱗癌放射照射后miRNA表達是否和調(diào)控DNA修復有關(guān)。

1 材料與方法

1.1試劑和細胞食管鱗癌細胞系EC109由鄭州大學消化疾病研究所提供，培養(yǎng)于質(zhì)量濃度為100 g/L的新生牛血清(Thermo產(chǎn)品)、青鏈霉素(各100 U/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基中(BI產(chǎn)品)，培養(yǎng)條件37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2。

1.2X線照射待細胞生長至對數(shù)期時，用X射線對細胞進行照射，根據(jù)照射劑量分為五組(0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy)。X射線采用瑞典醫(yī)科達公司直線加速器，型號：Synergy，速率2 Gy/min。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞，提取細胞中的RNA或用蛋白裂解液提取蛋白。

1.3細胞中總RNA的提取用Trizol(Invitrogen)提取細胞中的RNA。按照說明書，1×106細胞用1 ml Trizol裂解后，加入200 μl氯仿；震蕩15 s后，靜置3 min；12 000×g離心10 min，取上層透明水相；加入500 μl異丙醇，震蕩后靜置10 min；12 000×g離心10 min；棄上清，用質(zhì)量濃度為750 g/L的乙醇洗滌RNA沉淀1次；棄掉乙醇后，置于通風櫥干燥30 min；加入50 μl超純水溶解RNA。RNA處理過程中需注意RNase污染，所用試劑均用無RNase水配置，耗材為無RNase產(chǎn)品。RNA樣品溶解后用質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察完整性；用NanoDrop 2000測定濃度。miRNAs引物由GenePharma公司合成提供，mRNA檢測引物由上海生工合成(見表1)。

表1 本實驗所用引物

1.4RNA的逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)Thermo Scientific(DNA-PKcs)和GenePharma(miR-126/miR-101/miR-21)試劑盒說明書進行，所有操作均在冰上進行。DNA-PKcs的cDNA反應(yīng)體系為20 μl，含5×RT緩沖液4 μl、10 mmol/L dNTPs 2 μl、200 U/μl M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μl、20 U/μl RNA酶抑制劑1 μl、0.2 μg/μl逆轉(zhuǎn)錄隨機引物1 μl、總RNA 1 μg、無RNase水補足至20 μl；反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，37 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。

miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μmol/L引物1.2 μl、RNA 1 μg、5×RT緩沖液4 μl、10 mmol/L dNTP 0.75 μl、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μl、無RNase水補足至20 μl。反應(yīng)條件：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.5熒光定量PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為20 μl，包括2×qPCR Master Mix(SYBR) 10 μl、引物(10 μmol/L)0.4 μl、Taq DNA多聚酶(5 U/μl)0.2 μl、Template cDNA 3 μl，雙蒸水補足至20 μl，ABI PRISM 7500 PCR儀器對cDNA進行擴增，并繪制熔解曲線。miRNA反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 3 min 1個循環(huán)，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s 40個循環(huán)。DNA-PKcs反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。用熔解曲線檢測引物的特異性。miRNA的表達水平用內(nèi)參U6snRNA標準化，DNA-PKcs表達水平用內(nèi)參β-actin標準化，2-△△Ct法計算表達量。

1.6免疫印跡(Westernblotting) 細胞收集后，用蛋白裂解液提取細胞中的蛋白，質(zhì)量濃度為100 g/L的分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h×250 mA(DNA PKcs轉(zhuǎn)膜12 h)。質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA室溫封閉1 h。兔抗人DNA PKcs為1∶3 000，β-actin為1∶4 000，4 ℃孵育過夜。TBST然后洗膜3次后，二抗孵育60 min。洗膜3次后ECL染色，用FluorChem FC3成像儀采集和灰度分析，β-actin作為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌細胞系EC109放射照射后miR-126、miR-21、miR-101和DNA-PKcsmRNA及蛋白的表達情況經(jīng)過單因素方差分析，食管鱗癌細胞系EC109放射照射24 h后，miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表達升高(P<0.05)；miR-21有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。食管鱗癌細胞系EC109放射照射24 h后，隨著照射劑量增加，DNA-PKcs蛋白表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖2)。

注：圖1中miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs定量PCR結(jié)果采用ANOVA分析，F(xiàn)值分別是9.346、13.204、0.844、43.231；圖2采用ANOVA分析，F(xiàn)=0.6414，P=0.6451。

圖1食管鱗癌細胞系EC109放射照射后miRNAs及DNA-PKcsmRNA的表達；圖2食管鱗癌細胞系EC109放射照射后DNA-PKcs蛋白表達

Fig1ExpressionsofmiRNAsandDNA-PKcsmRNAinesophagealsquamouscellcarcinomacelllineEC109afterradiation;Fig2ExpressionofDNA-PKcsproteininesophagealsquamouscellcarcinomacelllineEC109afterradiation

2.2食管鱗癌細胞系EC109放射照射后miR-126、miR-21和miR-101水平與DNA-PKcsmRNA水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，食管鱗癌細胞系EC109放射照射后miR-126、miR-101、miR-21表達水平與DNA-PKcs mRNA表達無明顯相關(guān)性(P>0.05)。而miR-21與DNA-PKcs mRNA表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.885(P=0.008)。

3 討論

3.1放射照射后DNA-PKcsmRNA表達升高DNA-PKcs是DNA-PK的催化亞基，在非同源末端連接(NHEJ)中發(fā)揮重要作用，其可以介導DNA雙鍵斷裂的修復[6]。食管癌的放療抵抗性是導致治療失敗的主要原因，放療抵抗性主要的機制之一是PI3K/Akt信號通路的過度激活，AKT通過刺激DNA-PKcs有助于DNA雙鍵斷裂的修復。因此，抑制DNA-PKcs可以導致DSB修復失敗，進而增加電離輻射誘導的細胞毒性[7-8]。TOULANY等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雙重抑制PI3K和MEK可以增強A549和H460的放療敏感性。因此，研究其放療抵抗性機制、尋找放射增敏劑是提高食管鱗癌療效的途徑之一。

DE ANDRADE等[10]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，照射后(4 Gy、6 Gy)膠質(zhì)瘤細胞株中DNA-PKcs的表達升高。與在正常的肝細胞中相比，肝癌細胞株HepG2中的DNA-PKcs蛋白表達升高[11]；60 Gy電離輻射進一步增強DNA-PKcs表達，說明DNA-PKcs在電離輻射的DNA修復中起著關(guān)鍵的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量X-Ray照射后食管鱗癌細胞系EC109后24 h，DNA-PKcs mRNA表達升高，且差異有統(tǒng)計學意義。盡管DNA-PKcs蛋白表達的分析顯示，差異無統(tǒng)計學意義，但其蛋白表達有升高趨勢?？赡芘c照射劑量、收集細胞的時間點有一定關(guān)系，因為照射處理后，mRNA的表達變化最先發(fā)生，然后通過增強蛋白的翻譯，表現(xiàn)為蛋白表達升高。

3.2放射照射后miRNAs的變化miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼的小RNAs，在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)細胞生命進程，包括細胞生長、分化、增殖、凋亡等過程[12]。miRNAs和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，也有可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的放射敏感性[13]。因此，篩選DNA-PKcs相關(guān)的miRNAs，有助于揭示miRNAs調(diào)節(jié)DNA修復的機制，從而發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞的放療敏感性相關(guān)的miRNAs，并找到提高其放療敏感性的新靶點。目前關(guān)于miRNAs與食管癌放療敏感性及其與DNA-PKcs關(guān)系的研究少見報道。

我們選擇了與食管鱗癌相關(guān)的3種miRNAs。miR-21作為原癌基因和腫瘤發(fā)生相關(guān)[14]。MA等[15]報道，下調(diào)miR-21可以通過抑制PI3K/Akt信號通路來增強非小細胞肺癌細胞株A549的放療敏感性。本研究用2～8 Gy照射EC109后，盡管沒有發(fā)現(xiàn)miR-21表達差異有統(tǒng)計學意義，但有下降趨勢，且miR-21的水平與DNA-PKcs mRNA呈負相關(guān)，提示miR-21可能對DNA-PKcs mRNA表達有調(diào)節(jié)作用。SASAKI等[16]研究發(fā)現(xiàn)，輻射后(30 Gy)膠質(zhì)瘤細胞株中miR-21的表達升高，但60 Gy輻射后膠質(zhì)瘤細胞株中miR-21的表達消失。因此，進一步探討高劑量放射照射，將會進一步揭示miR-21的變化。

miR-126在人食管鱗癌組織中低表達，且通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路抑制EC109細胞的增殖和遷移[17]。miR-126可以調(diào)節(jié)PI3K信號通路，影響磷酸化的AKT表達進而抑制腫瘤生長[18]；放射治療后患者的外周血中miR-126表達升高，提示其可以作為放療敏感性的一個標志物[19-20]。miR-101在食管鱗癌組織和多種細胞系中低表達[21]，轉(zhuǎn)染miR-101的肺癌細胞株對電離輻射更加敏感；miR-101可通過靶向調(diào)節(jié)DNA-PKcs和ATM來增強肺癌細胞株的放療敏感性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量X-Ray照射后食管鱗癌細胞系EC109中miR-126和miR-101表達升高，但未發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-126與DNA-PKcs之間有相關(guān)性，與肺癌中miR-101靶向DNA-PKcs的研究結(jié)果不一致[22]，可能與腫瘤類型差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌細胞系EC109中X-Ray照射后miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表達上調(diào)，而miR-21與DNA-PKcs mRNA表達呈負相關(guān)，這些變化提示，放射損傷導致的DNA修復過程中，miRNA可能發(fā)揮著調(diào)控作用。

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