時(shí)玉龍，易成臘，劉濤，謝杰，何立，周方圓

外泌體（exosomes）來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡小體（multivesicular bodies，MVBs），經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后由細(xì)胞主動(dòng)分泌到胞外，釋放到胞外基質(zhì)中，直徑30～100 nm[1]。作為一種細(xì)胞間交流的載體，外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與形成神經(jīng)元-膠質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展及損傷修復(fù)中起著重要的調(diào)控作用。大量研究顯示，外泌體不僅可作為生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)還具有良好的治療潛能。本文主要對外泌體的一般特性、功能及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 外泌體的定義及研究背景

Pan和Johnstone等[2,3]于1983年在體外研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程時(shí)，通過超速離心從綿羊紅細(xì)胞上清液中分離到一種小囊泡，其可以被體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞釋放，并保留鐵傳遞蛋白受體和許多膜相關(guān)蛋白，電子顯微鏡下為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，呈圓形或凹杯狀外形，后來被命名為exosomes，即外泌體。早期研究認(rèn)為，外泌體的功能僅僅為轉(zhuǎn)運(yùn)、清除細(xì)胞內(nèi)非必需蛋白及其他分子，起“細(xì)胞垃圾袋”的作用。1996年Raposo等[4]發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞分泌的外泌體有呈遞抗原、激活T淋巴細(xì)胞、參與免疫細(xì)胞功能調(diào)控的功能。深入研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有機(jī)體細(xì)胞都可產(chǎn)生外泌體，其廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中[1,5,6]。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA在生理及病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，是細(xì)胞與細(xì)胞間遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移及信息交流的重要載體[7,8]。近幾年，對外泌體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制探索及外泌體協(xié)助疾病診治的研究是科研前沿及熱點(diǎn)。

2 外泌體的起源、結(jié)構(gòu)及作用方式

外泌體是由胞內(nèi)多囊泡小體與細(xì)胞質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外的一種膜泡。其形成過程主要?dú)v經(jīng)以下階段：細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成內(nèi)涵體并釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，多個(gè)內(nèi)涵體融合形成早期內(nèi)體（early endosome）；早期內(nèi)體再次內(nèi)陷以包裹細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)形成管腔內(nèi)小囊泡，此時(shí)稱為晚期內(nèi)體（late endosome）即多囊泡小體，該過程主要通過內(nèi)涵體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系 統(tǒng) 完 成 。 ESCRT 系 統(tǒng) 由ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II和ESCRT-III 4個(gè)復(fù)合物與其它一些輔助組分構(gòu)成。ESCRT-0的主要功能是識別和富集底物，通過泛素化的結(jié)合位點(diǎn)與早期內(nèi)涵體外表面的特異性受體結(jié)合，通過ESCRT-Ⅰ與ESCRT-Ⅱ輔助，以內(nèi)出芽的形式將其包裹形成管腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles，ILVs），ESCRT-Ⅲ經(jīng)Alix蛋白識別出芽小泡并剪切其頸部，使小泡釋放到內(nèi)涵體腔內(nèi)，形成成熟的晚期內(nèi)涵體，即多囊泡小體[1,6]。多囊泡小體亦可通過神經(jīng)酰胺類鞘脂信號分子[9]、四次跨膜糖蛋白[10,11]及Rab GTP酶[12]等非依賴ESCRT的分選機(jī)制途徑形成；這2種機(jī)制完全獨(dú)立抑或相互作用還需進(jìn)一步研究。當(dāng)多囊泡小體與細(xì)胞質(zhì)膜融合時(shí)可將其內(nèi)的小囊泡經(jīng)胞吐的方式釋放到細(xì)胞外間隙，即形成外泌體。外泌體以自分泌、旁分泌或激素樣分泌的方式到達(dá)“受體細(xì)胞”，并與“受體細(xì)胞”膜融合時(shí)將其包裹的信號分子作用于“受體細(xì)胞”，調(diào)節(jié)“受體細(xì)胞”的功能，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間的通訊。

外泌體由脂質(zhì)雙分子層膜及包裹攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、基因等組成。其內(nèi)容物按來源可分為2大類：結(jié)構(gòu)分子和貨物分子[5]。不論外泌體來源于何種類型母細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)分子都是獨(dú)特的，并且在保持外泌體的基本結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用；貨物分子主要是由外泌體分選、包裹和運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)。貨物分子隨外泌體起源的母細(xì)胞及外泌體產(chǎn)生時(shí)的生理或病理情況而不同，其形成過程被認(rèn)為是選擇性的，因?yàn)樵谕饷隗w中檢測到一些在母細(xì)胞中幾乎檢測不到的成分[1,5,13]。某些蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)分子）在不同來源的外泌體中均有表達(dá)，可作為鑒定外泌體種類的蛋白標(biāo)志物，如四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、多囊泡體形成相關(guān)蛋白（如ALG-2相互作用蛋白X、Tsg101、ESCRT、Alix蛋白）、胞質(zhì)酶（如GAPDH、過氧化物酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶等）、分子伴侶（如HSP60、HSP70、HSP90等熱休克蛋白和小熱休克蛋白），膜運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄈ鏡ab蛋白、膜聯(lián)蛋白）、細(xì)胞骨架蛋白（如肌動(dòng)蛋白和微管蛋白）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（如蛋白激酶和異源三聚體G蛋白）[1,5,13]。

外泌體表達(dá)的特異蛋白可揭示其來源于何種母細(xì)胞，例如主要組織性相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-1及MHC-Ⅱ提示其來源于B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞[5,14]，來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體表達(dá)LAMP1[15]。外泌體膜由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，同時(shí)脂質(zhì)亦是外泌體的主要成分，其富含膽固醇、甘油、甘油磷脂、磷脂、鞘脂類及糖基神經(jīng)酰胺（包括鞘磷脂和神經(jīng)酰胺）等。這些脂類分子不僅參與維持外泌體的形態(tài)，同時(shí)參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等許多生物學(xué)過程。由于脂質(zhì)保護(hù)功能，外泌體的內(nèi)含物可不被降解，長時(shí)間、長距離的運(yùn)輸仍能保持生物活性?？勺鳛榫哂猩锘钚晕镔|(zhì)如前列腺素、白三烯、脂肪酸等的運(yùn)載體及脂類相關(guān)疾病的生物標(biāo)記物[16-18]。

除了蛋白質(zhì)和脂類，外泌體還含有眾多功能性RNA分子，包 括 mRNAs和 非 編 碼 RNAs，如 微 小 RNAs（microRNA，miRNAs）和 長 鏈 非 編 碼 RNAs（longnoncoding RNAs，lncRNAs），這些遺傳物質(zhì)可經(jīng)由外泌體與靶細(xì)胞特異性膜融合后進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮遺傳信息交流功能[19-21]。由于外泌體由胞膜凹陷內(nèi)出芽并包裹加工胞漿內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)形成，所以外泌體不含線粒體、溶酶體等細(xì)胞器及細(xì)胞核[13]。

外泌體作為細(xì)胞-細(xì)胞交流媒介，其作用于靶細(xì)胞的方式主要有3種：外泌體表面的配體直接與靶細(xì)胞受體結(jié)合；膜上蛋白經(jīng)蛋白酶水解后的可溶性成分與靶細(xì)胞受體結(jié)合；通過靶細(xì)胞的融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用。外泌體這種特異識別靶細(xì)胞的功能可以避免被隨機(jī)傳送到其他組織細(xì)胞，從而發(fā)揮靶向治療作用，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供藥物載體，通過膜融合可以水平轉(zhuǎn)移內(nèi)含物到靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)活性[5,13,14]。

3 外泌體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系及應(yīng)用

機(jī)體幾乎所有細(xì)胞都可產(chǎn)生外泌體，其廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中[1,5,6]。組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等在病理、生理刺激時(shí)亦可分泌外泌體。外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，攜帶重要的生物活性分子，在神經(jīng)細(xì)胞間交流通訊發(fā)揮著重要的信使功能，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥感染、退行性疾病等發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷及治療起著重要的作用[22-24]。

3.1 外泌體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤

膠質(zhì)細(xì)胞瘤分泌的外泌體可促進(jìn)腫瘤生長，不同的腫瘤類型運(yùn)輸不同種類的RNA和蛋白質(zhì)，通過檢測外泌體攜帶的生物標(biāo)志物，可用于腫瘤類型的鑒別和診斷[25,26]。αβ-晶狀體蛋白（cryab）是熱休克蛋白家族中最重要的基因之一，cryab在腫瘤中高表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，與腫瘤患者的預(yù)后有著密切關(guān)系。膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的外泌體的cryab大部分呈非磷酸化狀態(tài)，磷酸化cryab后抑制外泌體對其包裹，阻斷外泌體的形成過程，減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)外泌體產(chǎn)生cryab[27]。若將膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體嵌頓于樹突狀T細(xì)胞表面，可引發(fā)惡性膠質(zhì)瘤患者自體CD8（+）細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）針對自體腫瘤細(xì)胞的特異性吞噬殺傷反應(yīng)，這是因?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體攜帶抗原遞呈分子、腫瘤抗原分子、黏附分子，當(dāng)這些外泌體嵌頓于樹突狀細(xì)胞表面可使其激活T淋巴細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性吞噬殺傷作用，這也為腫瘤的治療開辟了可能途徑[28]。

3.2 外泌體與中樞神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)細(xì)胞的死亡是中樞神經(jīng)退行性變的一個(gè)主要原因，也是 阿爾 茨 海 默 ?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金 森 ?。≒arkinson’s disease，PD）等神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志。以上疾病都涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中受累區(qū)域蛋白的聚集和內(nèi)含物形成。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確分選和降解對于維持神經(jīng)元的健康狀態(tài)十分重要。外泌體與神經(jīng)退行性疾病中突變的異常折疊蛋白的傳播有關(guān)，這些“毒性”蛋白可以作為寡聚體形成模板。神經(jīng)元通過胞內(nèi)體途徑對這些蛋白進(jìn)行加工，并嘗試去除這些聚集的蛋白，最終這些蛋白被降解進(jìn)入溶酶體或者合并入多囊泡小體，后者最終以外泌體的形式釋放入胞外環(huán)境中[23,29,30]。

β淀粉蛋白（amyloid β，Aβ）42作為AD特征性老年斑的主要成分，聚集在多囊泡小體中。AD患者體內(nèi)的Aβ42出現(xiàn)病理性富集，同時(shí)降解清除途徑也被阻斷，外泌體在毒性Aβ42的降解和毒性肽段的聚集方面均有一定作用[31,32]。星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可富集Aβ42并阻斷其降解，從而加重AD的認(rèn)知功能障礙[33]；而敲除中性神經(jīng)鞘磷脂酶、沉默外泌體miRNA可阻斷上述過程，延緩AD病程進(jìn)展，并提高認(rèn)知功能[31-34]。以外泌體為載體的siRNA遞送可靶向阻斷神經(jīng)元β位APP剪切酶-1蛋白（AD中的治療靶標(biāo)）的mRNA和蛋白的表達(dá)，極具治療前景[35]。

PD最重要的病理學(xué)改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失及殘存多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成以α-突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體，即路易氏小體。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可作為診斷PD的生物標(biāo)記物。PD患者腦脊液的血漿外泌體α-突觸核蛋白[36]、Tau蛋白[37]含量顯著高于正常人，但是AD患者腦脊液外泌體中Tau蛋白含量卻較正常人低[37]。外泌體可在神經(jīng)元間傳遞α-突觸核蛋白并在受體細(xì)胞中沉積，從而加速神經(jīng)元細(xì)胞死亡，促進(jìn)PD發(fā)展[38]。PD患者腦脊液產(chǎn)生的外泌體可選擇性過表達(dá)或抑制某些miRNA表達(dá)，因此檢測外泌體特定miRNA變化可用于鑒別PD及和AD[39]。由于納米分子大小的外泌體可自由穿透血腦屏障，且其脂質(zhì)分子層特性不被降解，并且對外泌體進(jìn)行修飾后可使其與靶細(xì)胞特異性識別后進(jìn)行膜融合，水平轉(zhuǎn)移攜帶的分子，其可被用于作為治療PD疾病藥物的載體，進(jìn)行靶向治療[35,40]。

3.3 外泌體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到創(chuàng)傷后，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元顯著表達(dá)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein-1，NLRP1）炎性體、細(xì)胞凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1。在脊髓及腦損傷后的腦脊液中發(fā)現(xiàn)NLRP1富集，利用基因工程技術(shù)將siRNA裝載于神經(jīng)元來源的外泌體上可阻斷ASC表達(dá)，減輕中樞神經(jīng)損傷；抑制半胱氨酸蛋白酶-1及炎癥因子的表達(dá)，以外泌體為載體的siRNA治療可阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后炎癥體釋放[24]。多功能干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可顯著增加腦損傷后病灶周圍的新生內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元數(shù)量，減輕炎癥癥狀，是一種腦損傷后無細(xì)胞治療的新方法[41]。多功能干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體同神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行膜融合后，可將攜帶的miR-133b水平轉(zhuǎn)入神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)軸突修復(fù)生長，減輕大腦中動(dòng)脈閉塞引起的神經(jīng)創(chuàng)傷[42]。從脊髓損傷小鼠腦脊液中獲取的外泌體可上調(diào)神經(jīng)元ERK信號通路的表達(dá)，促進(jìn)軸突生長并抑制神經(jīng)元凋亡，而正常小鼠腦脊液的外泌體不具備這種功能，但詳細(xì)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究[43]。對創(chuàng)傷性腦損傷患者循環(huán)體液的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)及基因組譜分析，可對腦損傷發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程實(shí)時(shí)檢測，并可評估治療效果，若結(jié)合生物活性標(biāo)記物可提高準(zhǔn)確率及特異性[44]。

炎癥可以使細(xì)胞變性壞死，使神經(jīng)細(xì)胞去髓鞘化，進(jìn)而引起嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可顯著減輕脂多糖引起的炎癥性神經(jīng)元損傷，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，防止膠質(zhì)瘢痕形成，恢復(fù)神經(jīng)元髓鞘損傷和白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常改變，改善小鼠行為學(xué)及認(rèn)知功能[45]。

3.4 外泌體與腦卒中

研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著改善羊胎兒缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)損傷癥狀，這種保護(hù)作用可能與其旁分泌的某種微粒有關(guān)；這種含外泌體的細(xì)胞外微?？赏ㄟ^減少癲癇發(fā)作的總次數(shù)和持續(xù)時(shí)間來改善缺血缺氧腦損傷的腦功能，并且增強(qiáng)壓力感受器反射敏感性，抑制神經(jīng)元髓鞘的分化[46]。體外研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元和遠(yuǎn)端軸突可攝取外泌體，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的高表達(dá)miR-17-92外泌體可顯著促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生成、神經(jīng)發(fā)生和軸突生長。在短暫性腦缺血小鼠模型中靜脈注射高表達(dá)miR-17-92的外泌體，可增強(qiáng)神經(jīng)元可塑性，促進(jìn)功能恢復(fù)，該機(jī)制可能通過靶向磷酸酶和張力蛋白同系物，激活PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而抑制GSK-3β，促進(jìn)軸突生長[47]。目前以外泌體為載體的腦卒中藥物治療也有進(jìn)展，如姜黃素加載到胚胎干細(xì)胞外泌體上可減輕炎癥癥狀、抑制N-甲基D-天冬氨酸受體及GFAP表達(dá)，縮小病灶面積，改善小鼠行為學(xué)功能，利于缺血再灌注損傷后小鼠的神經(jīng)血管單位恢復(fù)[48]。

4 展望

外泌體是一種天然納米級的脂質(zhì)膜性小囊泡，幾乎所有細(xì)胞都可產(chǎn)生外泌體；外泌體能穿透各種生物屏障、具有穩(wěn)定性、特異性和靈敏性、高效運(yùn)送性等優(yōu)勢，是細(xì)胞-細(xì)胞物質(zhì)或信息交流的重要載體。外泌體參與了神經(jīng)系統(tǒng)成長發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞間通訊及疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，可作為診治鑒別疾病的重要工具及預(yù)測疾病發(fā)展變化的生物標(biāo)記物。通過基因工程技術(shù)可將歸巢肽有效地鑲嵌在外泌體表面，并在其中裝載藥物，在賦予外泌體靶向性的同時(shí)減少副作用。外泌體有望成為理想的靶向藥物運(yùn)送載體，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化治療。但目前對于外泌體的研究尚處初期階段，調(diào)控外泌體膜蛋白和內(nèi)容物分選的機(jī)制、實(shí)現(xiàn)外泌體長距離的靶向運(yùn)輸以及如何參與眾多復(fù)雜的神經(jīng)生理進(jìn)程等問題還未解決，仍需更多的研究。