哈麗娟，崔 建，劉曉娜，李 鐵*

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬傳統(tǒng)診療醫(yī)院，長春 130022）

目前，在針灸形態(tài)學方面，神經(jīng)示蹤技術已經(jīng)成為研究穴位神經(jīng)屬性的重要手段之一[1-6]。其中Alexa熒光素488和594結(jié)合霍亂毒素亞單B（AF488/594-CTB）熒光雙標記示蹤技術以其熒光色彩鮮明、退色慢等特點近年來越來越多的被用于這一研究領域，并在研究位于肢體的穴位方面顯示出良好的標記效果[7-8]。本研究將繼續(xù)利用這一技術優(yōu)勢，以大鼠的中脘和胃俞穴為切入點，分別采用呈綠色的AF488-CTB和呈紅色的AF594-CTB對其進行標記，并對標記到的感覺神經(jīng)元和運動神經(jīng)元的所在部位進行系統(tǒng)觀察。通過該項研究不僅可以揭示俞募穴相關神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)中的規(guī)律性聯(lián)系，同時還可以進一步揭示位于軀干部穴位相關神經(jīng)元的分布特征，從而，為針灸臨床的選穴處方提供神經(jīng)解剖學方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性成年Sprague Dawley（SD）大鼠5只，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)學科學院動物所提供，動物許可證號： SCKX -（軍）2007-004，飼養(yǎng)于12 h 光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由飲水和攝食。實驗過程嚴格遵守中國衛(wèi)生部醫(yī)學實驗動物使用指南。

1.2 AF488-CTB和AF594-CTB的微量注射 本研究以AF488-CTB和 AF594-CTB（Invitroger-Molecular Probes，Eugene，美國）為示蹤劑。在異氟烷吸入式麻醉下，用微量注射器將0.1%的AF488-CTB和AF594-CTB溶液各4 L分別緩慢注入大鼠的中脘和左側(cè)胃俞穴（參照《實驗針灸學》[9]，大鼠中脘穴位于腹白線上，約臍上20 mm，胃俞穴位于第十二胸椎下旁開約5 mm）。深度以不刺入腹腔為限，留針1 min后緩慢出針，防止藥液滲漏。蘇醒后的大鼠放回飼養(yǎng)箱中。

1.3 灌流及取材 示蹤劑注入72 h后，在10%烏拉坦（1 mL/100 g）深度麻醉下對實驗大鼠進行心臟灌流。操作方法：迅速剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室將輸液針管插入升主動脈，剪開右心耳，快速灌入生理鹽水150 mL，隨后灌入300 mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液（PB, pH 7.4）的固定液，約15 min內(nèi)灌流完畢。然后取出頸、胸、腰部脊髓和T5 - L3脊神經(jīng)節(jié)用于觀察。取出的組織放置于上述同樣的固定液中再固定2～4 h，然后存放于含25%蔗糖的0.1 mol/L PB（pH 7.4）中，并放置在4 ℃冰箱里直至組織完全下沉。其中脊神經(jīng)節(jié)按椎節(jié)定位，脊髓節(jié)段則按脊神經(jīng)根進入脊髓的部位來判定，同時參照脊髓節(jié)段定位相關文獻[10-11]。

1.4 冰凍切片的制備 用恒溫箱切片機（CRYOCUT-1800，德國）將脊神經(jīng)節(jié)制成20 mm厚的矢狀切片并貼附在陽離子載玻片上（Thermo，Erie Scientific Company，美國），放于暗處風干。另外，用冰凍切片機（Thermo，Microm International GmbH，德國）將脊髓制成40 mm厚的橫斷切片或水平切片，按順序分為6組分置于6孔培養(yǎng)皿內(nèi)并漂浮在0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）中，然后再裱貼到陽離子載玻片上放于暗處風干。在風干后的神經(jīng)組織切片上滴加50%的甘油，加蓋蓋玻片后即可直接用于觀察。

1.5 觀察方法 用熒光顯微鏡觀察組織標本中被標記的神經(jīng)元，其中標記的神經(jīng)元在未切的脊神經(jīng)節(jié)中即可以直接觀察到，見圖1（插頁一），其細節(jié)可以在相應的切片中觀察到。所有組織標本采用尼康光學圖像分析儀（日本）進行觀察和拍照。圖片最后經(jīng)Adobe Photoshop 6.0（Adobe Systems, San Jose, CA, 美國）進行處理。

2 結(jié)果

在相應的激發(fā)光下，AF488-CTB和AF594-CTB所標記到的神經(jīng)元分別呈綠色和紅色。其中標記的脊神經(jīng)節(jié)細胞表現(xiàn)為圓形或橢圓形，大小不一，見圖1（插頁一）；標記的運動神經(jīng)元胞體和樹突清晰明亮，見圖2（插頁一）。

2.1 AF488-CTB和AF594-CTB標記的感覺神經(jīng)元 被AF488-CTB和AF594-CTB標記的與中脘和胃俞穴相關的脊神經(jīng)節(jié)細胞均屬于初級感覺神經(jīng)元。前者以T9為中心對稱性分布在T6 - T13兩側(cè)的脊神經(jīng)節(jié)中，后者以T12為中心主要分布在注入側(cè)T8 - L2的脊神經(jīng)節(jié)中，見圖1（插頁一）。以一側(cè)脊神經(jīng)節(jié)為例，共觀察到了938個與中脘相關的感覺神經(jīng)元（n = 5），其數(shù)量依次為T9：273＞T10：242＞T11：180＞T8：105＞T12：60＞T7：36＞T6：22＞T13：20。而在胃俞穴注入側(cè)的脊神經(jīng)節(jié)共觀察到了1 378個感覺神經(jīng)元（n = 5），依 次 為 T12：359＞ T13：276＞ T11：226＞ T10：174＞T9：153＞L1：101＞T8：63 ＞L2：26。其對側(cè)的脊神經(jīng)節(jié)也觀察到少量的感覺神經(jīng)元。只有在胃俞穴注入側(cè)的T10 - T11脊神經(jīng)節(jié)中觀察到少量被AF488-CTB和AF594-CTB雙重標記的感覺神經(jīng)元，見圖1C1（插頁一）。

2.2 AF488-CTB和 AF594-CTB標記到的運動神經(jīng)元

綜合在脊髓橫斷切片和水平切片上觀察到的運動神經(jīng)元，其中被AF488-CTB標記的與“中脘”穴相關的運動神經(jīng)元以T9為中心分布在T5 - T10的脊髓前角第Ⅸ層的后內(nèi)側(cè)部，而被AF594-CTB標記的與 “胃俞”穴相關的運動神經(jīng)元以T12為中心分布在T10 -L1的脊髓前角第Ⅸ層的最前部，見圖2（插頁一）。同時看到少量標記的運動神經(jīng)元散在分布在頸膨大節(jié)段。由于脊髓各節(jié)段之間界限不明顯，運動神經(jīng)元數(shù)量沒有按節(jié)段分別進行計數(shù)。在選取的51張脊髓代表性橫斷和水平切片的左側(cè)，分別計數(shù)到38個和61個AF488-CTB和AF594-CTB標記的運動神經(jīng)元，沒有觀察到雙標記的運動神經(jīng)元。

3 討論

近年來，CTB作為一種高敏感度雙向示蹤劑，已成為穴位神經(jīng)屬性重要研究手段之一[12-14]。并且隨著AF-CTB的問世，使得神經(jīng)方面的研究有了更新的進展。與傳統(tǒng)的示蹤技術相比，AF488-CTB和AF594-CTB熒光雙標記示蹤技術具有高敏感、色彩鮮明、熒光持久、注射后部位局限、可同步雙重標記及不易受溶液中pH值影響、無需高濃度與耗費少等優(yōu)勢。這項技術被越來越多地用于神經(jīng)科學方面的研究[15-18]。根據(jù)本研究的結(jié)果并結(jié)合筆者以前的研究成果，充分表明這一技術在針灸形態(tài)學研究方面亦具有廣泛的應用前景。

從被標記感覺神經(jīng)元的分布上來看，中脘和胃俞穴相關的感覺神經(jīng)元均分布在多個脊神經(jīng)節(jié)中，并分別集中在各自對應的脊神經(jīng)節(jié)中。就中脘和胃俞穴相關感覺神經(jīng)元分布最集中的脊神經(jīng)節(jié)所在的節(jié)段而論，前者高于后者3個節(jié)段。另一方面，兩穴相關感覺神經(jīng)元在5個節(jié)段的脊神經(jīng)節(jié)又存在部分重疊。由此可見，二者之間既表現(xiàn)了各自在節(jié)段分布上的特異性又顯示出部分重疊性。鑒于存在少量的雙標記神經(jīng)元，說明有些感覺神經(jīng)元同時向中脘和胃俞穴發(fā)出了分支投射，這可能更有助于增強兩穴之間的內(nèi)在聯(lián)系。

從被標記運動神經(jīng)元的分布上來看，中脘和胃俞穴相關的運動神經(jīng)元在胸段脊髓也存在大約3個節(jié)段的差異，不僅如此，它們在脊髓前角的分布也表現(xiàn)出了區(qū)域性的不同。這些結(jié)果表明位于軀干部的穴位，無論是位于腹部的中脘還是位于背部的胃俞穴，其相關的神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)中相對應的節(jié)段和區(qū)域均呈規(guī)律性分布。這種不同穴位與神經(jīng)系統(tǒng)存在的節(jié)段和區(qū)域性聯(lián)系同樣也表現(xiàn)在位于肢體的穴位上面，所不同的是上、下肢的穴位主要對應的是頸膨大和腰膨大相關的節(jié)段和區(qū)域，而軀干部的穴位對應的更多是胸部脊髓相關的節(jié)段和區(qū)域[7-8,19]。從此種意義上講，本研究豐富了軀干部穴位與神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的內(nèi)容，為針灸臨床上的選穴處方，尤其是俞募配穴，提供了神經(jīng)解剖學依據(jù)。這將有助于在臨床治療中更好地利用不同穴位的特異性和互補性來發(fā)揮它們之間的協(xié)同和增效作用。

總之，通過本研究進一步證實了AF488-CTB和AF594-CTB熒光雙標記技術在針灸形態(tài)學研究中的有效性，揭示了大鼠中脘和胃俞穴相關神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布規(guī)律與特征。同時，本研究也為更好利用該項技術深入研究中脘和胃俞穴與胃在神經(jīng)系統(tǒng)中的聯(lián)系奠定了形態(tài)學基礎。