尚曉玲，高瑞芳

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

研究[1-5]表明，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是導(dǎo)致心血管和腦血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，不僅發(fā)病率高，病死率高，對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜[6-8]。鑒于AS是多因素影響的復(fù)雜病變，所以應(yīng)用復(fù)合因素的造模方法越來(lái)越受到廣大學(xué)者的重視[9]。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 試劑與儀器 維生素D2注射液（江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司）；TC試劑盒、TG試劑盒、HDL-C試劑盒、LDL-C試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀（包頭醫(yī)學(xué)院電器維修開(kāi)發(fā)部）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備 取192只清潔級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成6組。正常組32只，給予普通飼料飼養(yǎng)，分4、6、8、12周取材；假手術(shù)組32只，僅對(duì)大鼠左側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行剝離，然后以高脂飼料（3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油和81.3%基礎(chǔ)飼料）飼養(yǎng)，另外，在實(shí)驗(yàn)初腹腔注射60萬(wàn)u/kg 維生素D2（VD2）注射液，在第3、6、9周時(shí)再分別給予10萬(wàn)u/Kg；鉗夾組32只，對(duì)大鼠左側(cè)頸動(dòng)脈行鉗夾手術(shù)[10]，接下來(lái)高脂喂養(yǎng)和腹腔注射VD2；電擊組：總共96只大鼠，按電擊強(qiáng)度和時(shí)間分為3組：電擊1組（0.6 mA、5 min）、電擊2組（1 mA、5 min）、電擊3組（1.4 mA、5 min），每組32只，行電擊手術(shù)[11]。與假手術(shù)組、鉗夾組一樣喂養(yǎng)高脂飼料和腹腔注射VD2。

1.3.2 動(dòng)物標(biāo)本的留取 分4、6、8、12周取材。取左側(cè)頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)度約1.5 cm，放入10%中性福爾馬林液中固定，用于病理學(xué)檢測(cè)。后腹主動(dòng)脈采血，離心機(jī)3 000 r/min離心20 min，分離出血清，用于血液生化學(xué)檢測(cè)，用ELISA法檢測(cè)TC、TG、LDL-C、HDL-C。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，根據(jù)方差齊性結(jié)果選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，當(dāng)方差齊時(shí)選擇LSD，方差不齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況及體質(zhì)量變化 所有192只大鼠中，總共有11只死亡，其中假手術(shù)組死亡1只，鉗夾組死亡2只，電擊1組死亡1只，電擊2組死亡1只，電擊3組死亡6只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組大鼠體質(zhì)量均無(wú)明顯差異（P＞0.05），正常組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，其他5組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至后期下降。實(shí)驗(yàn)4、6、8、12周時(shí)，假手術(shù)組、鉗夾組、電擊1組、電擊2組、電擊3組體質(zhì)量均明顯低于正常組（P＜0.05）。

2.2 血脂結(jié)果 4、6、8、12周后，與正常組相比，假手術(shù)組、鉗夾組、電擊1組、電擊2組、電擊3組大鼠的TC、TG和LDL-C水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HDL-C明顯降低（P＜0.05）；4項(xiàng)指標(biāo)，假手術(shù)組、鉗夾組、電擊1組、電擊2組、電擊3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 頸動(dòng)脈病理變化 正常組大鼠頸動(dòng)脈無(wú)明顯變化，血管內(nèi)膜表面完整光滑，中膜一般由平滑肌細(xì)胞組成，外膜可見(jiàn)薄層的疏松結(jié)締組織（見(jiàn)圖1A—E）（插頁(yè)二）。假手術(shù)組4周時(shí)內(nèi)膜不光滑（見(jiàn)圖1F）（插頁(yè)二）；6周時(shí)內(nèi)膜輕微增生（見(jiàn)圖1G）（插頁(yè)二）；8周時(shí)血管內(nèi)膜增厚（見(jiàn)圖1H）（插頁(yè)二）；12周時(shí)血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞增生，中膜的平滑肌細(xì)胞減少向內(nèi)膜下遷移（見(jiàn)圖1I—J）（插頁(yè)二）。鉗夾組4周時(shí)內(nèi)膜增生但不明顯，外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1K）（插頁(yè)二）；6周時(shí)內(nèi)膜略增厚，平滑肌細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移（見(jiàn)圖1L）（插頁(yè)二）；8周時(shí)內(nèi)膜增生明顯，大量泡沫細(xì)胞存在（見(jiàn)圖1M）（插頁(yè)二）；12周時(shí)內(nèi)膜增厚明顯，向管腔凸出，大量的平滑肌細(xì)胞增殖移行至內(nèi)膜下，泡沫細(xì)胞沉積，部分可見(jiàn)鈣化，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，外膜處大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1N—O）（插頁(yè)二）。電擊1組4周時(shí)內(nèi)膜不光滑（見(jiàn)圖1P）（插頁(yè)二）；6周時(shí)內(nèi)膜微微增厚（見(jiàn)圖1Q）（插頁(yè)二）；8周時(shí)內(nèi)膜增厚比較明顯（見(jiàn)圖1R）（插頁(yè)二）；12周時(shí)內(nèi)膜增厚且有泡沫細(xì)胞沉積，中膜彈力纖維排列紊亂，中膜變?。ㄒ?jiàn)圖1S—T）（插頁(yè)二）。電擊2組4周時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)典型的電擊樣豎立狀，平滑肌細(xì)胞增殖，中膜間隙增寬（見(jiàn)圖1U）（插頁(yè)二）；6周時(shí)內(nèi)膜增厚比較明顯，有少量泡沫細(xì)胞存在（見(jiàn)圖1V）（插頁(yè)二）；8周時(shí)內(nèi)膜增厚明顯，有斑塊向內(nèi)凸起，平滑肌細(xì)胞排列紊亂、增生，泡沫細(xì)胞增多（見(jiàn)圖1W）（插頁(yè)二）；12周時(shí)大量平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜下，血管壁向管腔內(nèi)凸出，形成斑塊，斑塊內(nèi)含有泡沫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶，中膜萎縮，管腔變窄，呈現(xiàn)典型的AS病理變化（見(jiàn)圖1X—Y）（插頁(yè)二）。電擊3組4周時(shí)內(nèi)彈力板被破壞、中斷，彈力纖維脫落，動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)被完全破壞（見(jiàn)圖1Z）（插頁(yè)二）；6周時(shí)被破壞的結(jié)構(gòu)尚未恢復(fù)（見(jiàn)圖1a）（插頁(yè)二）；8周時(shí)內(nèi)膜增厚，中膜結(jié)構(gòu)混亂（見(jiàn)圖1b）（插頁(yè)二）；12周時(shí)內(nèi)膜增厚明顯，存在大量泡沫細(xì)胞，中膜結(jié)構(gòu)混亂，部分管壁增厚明顯，部分管壁結(jié)構(gòu)不完整，管腔內(nèi)有血栓存在（見(jiàn)圖1c—d）（插頁(yè)二）。

3 討論

研究[12]表明，高脂血癥是AS形成的主要危險(xiǎn)因素。張瑞環(huán)[13]通過(guò)臨床研究認(rèn)為，冠狀動(dòng)脈病變程度分別與LDL/HDL比值、致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AIP）呈正相關(guān)，與HDL呈負(fù)相關(guān)。所以，本次實(shí)驗(yàn)筆者采用了高脂喂養(yǎng)的方法。另外，研究[14]表明，人類動(dòng)脈硬化的血管壁中含有的大量鈣含量與冠心病的病變程度呈正相關(guān)，鈣的含量過(guò)高冠心病的危險(xiǎn)性也會(huì)加重。因此，在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上腹腔注射VD2?；诶钋锩穂11]、李振華[15]、陳曉軍[16]等的臨床研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，筆者采用了0.6、1、1.4 mA 3個(gè)值，刺激5 min來(lái)進(jìn)行模型制備。3組電擊組的病理學(xué)形態(tài)比較，電擊1組與假手術(shù)組病理變化程度差不多，可能因?yàn)?.6 mA時(shí)電擊強(qiáng)度不夠，沒(méi)有對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜造成比較有效的損傷。電擊3組雖然頸動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)了增厚，但是電擊造成的損傷嚴(yán)重，動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，不符合人類動(dòng)脈粥樣硬化病變，且大鼠死亡率亦增高。而電擊2組采用1 mA、5 min比較好地形成了典型的動(dòng)脈粥樣硬化。鉗夾組和電擊2組都出現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化的病理表現(xiàn)，說(shuō)明在接近的時(shí)間內(nèi)，人為的損傷動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)于僅給予大鼠高脂飼料加VD2負(fù)荷更容易形成動(dòng)脈粥樣硬化。并且單純的高脂飼料加VD2沒(méi)有兼顧到其他導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成的因素，僅僅導(dǎo)致了平滑肌增生和動(dòng)脈內(nèi)膜一定程度的增厚，并沒(méi)有成熟的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

綜上，通過(guò)對(duì)高脂飼料、電擊電流強(qiáng)度的多次實(shí)驗(yàn)篩查，最終大鼠高脂飲食、腹腔注射VD2加頸動(dòng)脈電擊損傷（1 mA、5 min）復(fù)合因素所致的動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功。此方法所制作的動(dòng)物模型從動(dòng)脈粥樣硬化的脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣超載、內(nèi)皮損傷等多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)出發(fā)，突破了傳統(tǒng)的單應(yīng)用鉗夾法制作模型的造模方法，成為一種新型的價(jià)格低廉、有典型病理改變的動(dòng)脈粥樣硬化模型復(fù)制方法。