周曉晶，李 晶，明容美，于江波，王永彬，邢日新，孫 鵬

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130017； 2.吉林省人民醫(yī)院，長春 130021；3.吉林敖東藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700）

原發(fā)性肝癌具有高發(fā)病率、高病死率的特點[1]，腫瘤細胞的侵襲轉移是其主要危險因素[2]?；诋斚略l(fā)性肝癌根治率相對較低、復發(fā)率高及易轉移的現(xiàn)狀，中醫(yī)中藥在腫瘤的防治中已凸顯成效[3-4]。根據(jù)“扶正兼祛邪”的原則，扶正清解方具有益氣養(yǎng)陰、消癰散結及抗腫瘤多種功效，臨床上被用于消化系統(tǒng)腫瘤的輔助治療[5-8]。本研究基于扶正清解方中各組分的不同抗腫瘤作用和自主設計的寡聚脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotide ODN）的誘導天然免疫、協(xié)同抗腫瘤作用[9-12]，旨在利用ODN誘導的天然免疫[13-15]和扶正清解方的多靶點作用相互協(xié)調，從而達到抑制肝癌細胞轉移的目的，為臨床治空治肝癌的轉移提供思路和理論依據(jù)。

1 實驗材料

實驗藥品：扶正清解方，成分：黃芪30 g，女貞子15 g，夏枯草15 g，白花蛇舌草30 g，靈芝30 g，淮山藥15 g。購自長春同仁堂藥店，藥物質量符合中華人民共和國藥典標準。以上藥物在水中浸泡30 min，水提，合并濾液，抽真空過濾，旋轉蒸發(fā)儀濃縮后轉移至蒸發(fā)皿，于蒸發(fā)皿上揮干，于真空干燥箱進行干燥。加入IMDM培養(yǎng)液配成（生藥含量2.66 g/mL），于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；ODN，由上海生物工程公司合成，溶解稀釋保存于-20 ℃冰箱備用。細胞：人肝癌細胞HepG2細胞株液氮冷凍儲存，為懸浮生長，使用10% FBS IMDM 培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測HepG2細胞增殖 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HepG2細胞，用10% FBS IMDM制備成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中（4×104個/mL），于CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)過夜。設置各組，37 ℃培養(yǎng) 12、24、36、48、60、72 h。在檢測前4 h加入 MTT溶液（5 mg/mL，20 μL/孔），4 h 后吸棄上清液， 且每孔加入 150 μL 二甲亞砜溶解沉淀，振蕩 10 min，用酶標儀在 570 nm 波長處測吸光度（OD 值）。計算細胞生長抑制率。抑制率=（1 －給藥組 OD 值/對照組OD 值）×100%。以培養(yǎng)時間為橫軸，抑制率值為縱軸繪制細胞增殖抑制時效關系曲線。

2.2 劃痕實驗檢測HepG2細胞遷移能力 用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HepG2細胞，用10% FBS IMDM制備成單細胞懸液，接種于6孔板（1×106個細胞/孔），37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸掉培養(yǎng)液，PBS進行2次洗滌，用加樣器頭沿著培養(yǎng)板底部劃“一”字形痕跡，再次用PBS洗去未貼壁細胞，然后按組加入成分不同的培養(yǎng)液。記錄加入不同培養(yǎng)液0 h劃痕間距，于24 h觀測劃痕間距。用如下公式進行計算遷移率：n h細胞遷移率= [1－邊緣距離（nh）/邊緣距離（0h）]×100%。[16]

2.3 Transwell小室檢測HepG2細胞侵襲轉移能力 在transwell上室涂1 mg/mL的Matrigel凝膠，37 ℃溫育30 min。取用低血清IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h的HepG2細胞，調整細胞數(shù)至1×106/mL，取100 μL細胞接種于transwell上室，對照組加入等體積無血清IMDM培養(yǎng)液；transwell下室加入含15% FBS的IMDM培養(yǎng)液600 μL， 37℃、5% CO2 培養(yǎng) 24 h，然后吸去上室的培養(yǎng)液，利用100%甲醇固定細胞20 min，吸去甲醇，PBS清洗2次。然后避光，用Giemsa染色15 min，將Giemsa吸去，PBS洗滌2次，用棉簽抹去濾膜上層未穿過膜的細胞并風干，在光鏡下記錄膜背面細胞數(shù)，在膜上下左右中5個不同視野（×40）取平均值，按如下公式計算各組HepG2細胞的侵襲率。侵襲抑制率=（1 －加藥組平均侵襲細胞數(shù)/對照組數(shù)平均侵襲細胞數(shù)）×100%。[17]

3 結果

3.1 ODN協(xié)同扶正清解方對HepG2細胞增殖的抑制作用 MTT 實驗表明：ODN +扶正清解方組的HepG2細胞的生長在第24 h開始受到抑制，其細胞增值能力明顯低于對Medium組及單獨ODN組（P＜0.05），見圖1（見插頁四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細胞生長。

3.2 ODN協(xié)同扶正清解方對HepG2細胞遷移的抑制作用 遷移實驗提示，ODN+扶正清解方組的肝癌細胞與對照組相比，更少的細胞發(fā)生了遷移（P＜0.05），見圖 2（見插頁四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細胞遷移。

3.3 ODN協(xié)同扶正清解方對HepG2細胞侵襲的抑制作用 Transwel實驗顯示，ODN+扶正清解方組HepG2細胞加入Transwel上室以后24 h，穿過Matrigel 膠的細胞數(shù)目顯著低于對照組（P＜0.05），見圖3（見插頁四）。說明ODN可協(xié)同扶正清解方抑制HepG2細胞侵襲。

4 結語

肝癌細胞的高轉移侵襲性是肝癌高危性的重要原因，臨床研究表明，中醫(yī)藥在防止腫瘤的復發(fā)與轉移、提高患者的免疫系統(tǒng)功能、抑制腫瘤生長及腫瘤血管的生成、延緩患者的生命和提高生活質量等方面發(fā)揮著重要作用。扶正清解是由扶正抑瘤方和解毒消癃飲派生出來的[18]。扶正抑瘤方由黃芪、女貞子、靈芝、淮山藥組成。解毒消瘸飲由白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦參組成。方中黃芪、女貞子具有益氣養(yǎng)陰作用，為君藥；配以靈芝、山藥，取其扶正培本之功，為臣藥，夏枯草、白花蛇舌草具有苦寒，具有清熱解毒、消癰散結作用，為佐使藥[19]。研究發(fā)現(xiàn)，方中的各味藥在消化系統(tǒng)腫瘤中均可起到不同的作用。而且前期研究發(fā)現(xiàn)自主設計的ODN具有活化天然免疫作用，能夠輔佐乙肝表面抗原抑制對小鼠肝癌具有明顯抑制作用[20]。本研究在扶正清解方的基礎上輔以自主設計的ODN，研究其對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響。結果發(fā)現(xiàn)ODN可協(xié)助扶正清解方抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，侵襲和轉移。說明兩者聯(lián)合應用可多靶點抑制肝癌細胞侵襲轉移，可為肝癌侵襲轉移的防治提供實驗依據(jù)和研究思路。