袁敏，徐黎明，鄭娟，劉立寧，孫煥霞，劉一帆，李春先，郭芳惠，石顏軍

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城252000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以侵犯關(guān)節(jié)為主的系統(tǒng)性慢性自身免疫性疾病，該病致殘率較高，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化及組織器官的發(fā)育中具有重要作用[2, 3]。研究證實(shí)，lncRNA參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，并且可以作為疾病早期診斷和預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。最近研究[4，5]提示，lncRNA可以作為靶向治療的靶點(diǎn)來達(dá)到緩解甚至治愈疾病的目的。目前關(guān)于lncRNA在RA中的表達(dá)情況以及與RA關(guān)系的研究較少。本研究篩選并驗(yàn)證了lncRNA在RA外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中的異常表達(dá)情況，為RA早期診斷、病情評(píng)估及發(fā)病機(jī)制的探索提供一定的思路。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

選擇2016年7～12月在我院就診的RA患者63例，男16例、女47例，年齡20～62歲，病情活動(dòng)指標(biāo)簡(jiǎn)化疾病活動(dòng)指數(shù)(SDAI)評(píng)分5.3～47(23.13±10.97)分。所有RA患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟制定的分類標(biāo)準(zhǔn)。來自健康查體中心的健康志愿者51例作為對(duì)照，男10例、女41例，年齡24～60歲。兩者性別、年齡具有可比性。本研究通過聊城市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得研究對(duì)象或家屬知情同意。

1.2　PBMCs的分選

使用EDTA抗凝管抽取受試者外周血10 mL，利用人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液進(jìn)行分選，血細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及單個(gè)核細(xì)胞的純度檢測(cè)。

1.3　lncRNA在PBMCs中的異常表達(dá)檢測(cè)

采用高通量基因芯片技術(shù)。選取27例女性RA患者(平均年齡49.02歲)和27例女性健康志愿者(平均年齡51.04歲)，分別隨機(jī)分成3組，將每組的PBMCs等量混勻，用TRIzol進(jìn)行充分溶解。芯片檢測(cè)由上?？党缮锛夹g(shù)有限公司完成。采用Arraystar公司人類lncRNA芯片V4.0進(jìn)行基因檢測(cè)，該芯片能夠檢測(cè)40 173個(gè)lncRNA，lncRNA是從權(quán)威公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(包括Refseq、UCSC knowngenes、Gencode等)和高影響因子論文中挑選的。操作步驟如下：采用TRIzol試劑盒提取樣本RNA，抽提的總RNA通過mRNA-ONLYTM真核 mRNA提取試劑盒移除rRNA后，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成熒光標(biāo)記的cRNA；cRNA經(jīng)過裂解、稀釋等處理后，均勻的標(biāo)記于lncRNA表達(dá)芯片平臺(tái)進(jìn)行芯片雜交。完成雜交的芯片用Agilent DNA芯片掃描儀掃描，再通過Agilent提取數(shù)據(jù)軟件(version 11.0.1.1)對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，最后用GeneSpingGX v12.1軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和分析。根據(jù)倍數(shù)變化值大于3倍、P<0.05、熒光信號(hào)的原始值>200的條件，篩選出異常表達(dá)的lncRNA。對(duì)異常表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，其中紅色代表高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)。

1.4　PBMCc中異常表達(dá)的lncRNA的驗(yàn)證

選取36例RA患者(男16例、女20例，平均年齡50.34歲)和24例健康志愿者(男10例、女14例，平均年齡48.55歲)，兩組性別及年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)方法，根據(jù)lncRNA長(zhǎng)度<2 000個(gè)堿基對(duì)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中是否有明確序列，鄰近基因是否和RA相關(guān)以及兩組之間差異倍數(shù)是否顯著的原則，選取4個(gè)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證。提取受試者的PBMCs，用TRIzol試劑盒提取樣本RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，采用SYBR green相對(duì)定量法進(jìn)行定量檢測(cè)。轉(zhuǎn)錄引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列如下：NR_002838上游引物序列為：5′-GAGCCGATCTTACAACCTC-3′，下游引物序列為：5′-TGGATCTCTACTAGCCACA-3′；ENST00000438380上游引物序列為：5′-CGAGCACTGATGAAGTCCACCA-3′，下游引物序列為：5′-TGAAGTCAGCCGCGTTCCAG-3′；ENST00000456270上游引物序列為：5′-AGCCAGCATAACAAGAGTTCC-3′，下游引物序列為：5′-ACACGTTCCAGTAGAATGCC-3′；NR_026812上游引物序列為：5′-ATTTATCGAACCTCACGGAGC-3′，下游引物序列為：5′-TCTTTAGCTTCTGTAGTTCGG-3′；ENST00000566394上游引物序列為：5′-CTAGAGTCCATGTTGGCCTT-3′，下游引物序列為：5′-TGCAGGTCTTCTATGACGTT-3′；GAPDH上游引物序列為：5′-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物序列為：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～60 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min以便檢測(cè)引物二聚體或非特性擴(kuò)增。采用ΔΔCT法進(jìn)行定量分析，計(jì)算2-ΔΔCT，即目的基因表達(dá)相對(duì)于GAPDH表達(dá)的倍數(shù)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組基因表達(dá)情況比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　lncRNA及mRNA在RA患者PBMCs的異常表達(dá)

共篩選出異常表達(dá)的lncRNA 242個(gè)，其中114個(gè)高表達(dá)，128個(gè)低表達(dá)。對(duì)上述異常表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，在熒光信號(hào)原始值<200的情況下，異常表達(dá)的lncRNA 469個(gè)，其中高表達(dá)30個(gè)、低表達(dá)439個(gè)。

2.2　異常表達(dá)lncRNA的驗(yàn)證結(jié)果

與RA相關(guān)的4個(gè)異常表達(dá)的lncRNA為ENST00000438380、NR002838、NR026812、ENST00000566394，其在RA患者PBMCs中的相對(duì)表達(dá)量分別為2.59±0.82、5.85±1.86、0.84±0.27、1.96±0.47，在健康志愿者PBMCs中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.64、3.46±1.05、1.76±0.43、2.39±0.64。RA患者ENST00000438380和NR002838表達(dá)水平升高，NR026812表達(dá)水平降低(P均<0.01)；ENST00000566394表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。將該結(jié)果與高通量基因芯片結(jié)果進(jìn)行比較，顯示上述4個(gè)lncRNA的變化趨勢(shì)一致。

2.3　lncRNAs與SDAI的相關(guān)性分析

對(duì)ENST00000438380、NR002838、NR026812與RA疾病活動(dòng)度指標(biāo)SDAI進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ENST00000438380與SDAI呈明顯正相關(guān)(r=0.784，P<0.01)，NR002838和NR026812與SDAI無明顯相關(guān)性(r=0.321，P=0.068；r=0.048，P=0.780)。

3　討論

隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)。雖然lncRNA不具有編碼蛋白的功能，但該類分子通過與RNA、DNA或蛋白質(zhì)相互作用，影響基因表達(dá)的每個(gè)環(huán)節(jié)，包括染色體重塑、基因印記、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工過程，增強(qiáng)或抑制編碼基因的表達(dá)[2，6，7]。免疫細(xì)胞活化的過程伴隨著一系列基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)來達(dá)到清除病原體、清除衰老死亡的細(xì)胞及消滅異常細(xì)胞的作用，而lncRNA在調(diào)控免疫細(xì)胞基因動(dòng)態(tài)表達(dá)及免疫細(xì)胞的發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用。研究認(rèn)為，lncRNA參與了自身免疫性疾病的發(fā)病過程[8～10]。Zhang等[11]觀察了RA患者關(guān)節(jié)滑膜中l(wèi)ncRNA的異常表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了135個(gè)異常表達(dá)lncRNA，其中62個(gè)lncRNA升高，73個(gè)表達(dá)降低。Yang等[12]在RA動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，紫草素通過上調(diào)lncRNA-NR024118表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，LOC100506036通過調(diào)節(jié)一系列基因表達(dá)SMPD1和NFAT1參與RA的炎癥反應(yīng)過程。目前關(guān)于lncRNA在RA外周血的異常表達(dá)的研究較少。本研究通過高通量基因芯片技術(shù)篩選了在RA患者PBMCs中的異常表達(dá)的lncRNA，并通過real-time PCR方法進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證。

由于在RA患者中女性所占比例在2/3以上，因此我們選取了27例女性RA患者，隨機(jī)分成3組，然后將每組的PBMCs等量混合，減少性別因素的干擾，確保芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。芯片結(jié)果顯示，異常表達(dá)的lncRNA半數(shù)以上都是表達(dá)下調(diào)，提示RA患者中基因表達(dá)缺失或表達(dá)量不足在發(fā)病過程中起一定的作用。通過對(duì)熒光信號(hào)原始值分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)量較mRNA相比普遍偏低，原始值小于200的lncRNA在總的異常表達(dá)的lncRNA中所占比例高達(dá)66%，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的lncRNA在細(xì)胞組織中低表達(dá)相吻合。另外，在lncRNA和編碼基因位置位置關(guān)系的分析中，發(fā)現(xiàn)基因間的lncRNA占50%以上，其次是和編碼基因內(nèi)含子區(qū)重疊的lncRNA,編碼基因外含子區(qū)重疊的lncRNA最少。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用，部分lncRNA對(duì)鄰近的編碼基因有增強(qiáng)子的作用[15]，提示在RA中異常表達(dá)的lncRNA通過影響鄰近編碼基因的表達(dá)參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。Zhang等[11]報(bào)道，在RA關(guān)節(jié)滑膜中部分異常表達(dá)的lncRNA比如ENST00000438399、uc004afb.1、ENST00000452247等，在本研究中未發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)或無表達(dá)，可能與lncRNA的細(xì)胞組織特異性有關(guān)。

本研究根據(jù)基因表達(dá)的熒光信號(hào)值、lncRNA的長(zhǎng)度是否小于2 000個(gè)堿基對(duì)以及在數(shù)據(jù)庫(kù)中是否有明確序列，選取了4個(gè)lncRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果相符，但表達(dá)倍數(shù)有一定差異，其原因可能與基因芯片和real-time PCR定量檢測(cè)的原理不同有關(guān)。此外本研究進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證的樣本為男女混合人群，其結(jié)果與進(jìn)行芯片分析的女性人群結(jié)果一致，進(jìn)一步提示了該芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性和代表性。對(duì)3個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義異常表達(dá)的lncRNA與RA病情活動(dòng)指標(biāo)SDAI進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示ENST00000438380與SDAI呈正相關(guān)，提示該lncRNA可以作為疾病活動(dòng)度的檢測(cè)指標(biāo)，有利于指導(dǎo)RA患者治療方案的調(diào)整。

綜上所述，本研究采用基因芯片技術(shù)篩查了RA患者外周血中異常表達(dá)的lncRNA，通過real-time PCR進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，證實(shí)RA患者PBMCs中異常表達(dá)的lncRNA包括NR002838、ENST00000438380、NR026812，其中ENST00000438380可作為評(píng)價(jià)RA疾病活動(dòng)性的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步探索RA的生物學(xué)標(biāo)志物以及發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。

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