朱聰，賈秀紅，劉迎雪

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一種起源于多能干細胞的血液系統(tǒng)腫瘤，其治療以化療為主。阿霉素(adriamycin，ADR)是CML的常用化療藥物，但多藥耐藥的發(fā)生，嚴重影響CML治療效果及療程[1～3]。多藥耐藥是影響CML化療療效的重要原因，尋找選擇性多藥耐藥逆轉劑已成為研究熱點。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局的統(tǒng)計，目前批準的抗腫瘤藥中有25%～48%來自植物，因此，天然化合物被認為是抗腫瘤藥物的潛在來源[4，5]。芍藥苷是從白芍中提取的一種多酚類化合物，具有抗腫瘤作用。芍藥苷可以通過抑制Notch-1信號通路而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[6]，通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信號通路而抑制子宮內膜癌細胞增殖[7]，通過上調HTRA3表達而抑制胰腺癌細胞生長[8]，通過誘導MAPK家族蛋白ERK、JNK、p-38表達而誘導白血病Jurkat細胞的凋亡[9]。但芍藥苷對白血病多藥耐藥的影響尚未有報道。2017年10月1日～2018年1月30日，我們觀察了芍藥苷對CML耐ADR細胞株K562/ADR多藥耐藥的逆轉作用，并探討其作用機制，為臨床應用芍藥苷輔助治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、細胞及試劑 芍藥苷購自鄭州卓峰制藥有限公司，純度>98%，溶解在二甲基亞砜(DMSO)中配成100 μmol/L的原液，貯存于-20 ℃冰箱中，實驗前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至目的濃度；ADR購自北京博奧森生物技術有限公司，用雙蒸水配成2 mg/mL的溶液。K562細胞株、K562/ADR細胞株由濱州醫(yī)學院腫瘤分子生物學實驗室提供。DMSO購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；細胞裂解緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、PVDF膜購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人MRP1、p38、p-p38多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；GADPH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 ADR對K562/ADR細胞、K562細胞的半抑制濃度(IC50)測算 采用CCK-8法檢測。K562細胞培養(yǎng)于RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)液中，K562/ADR細胞培養(yǎng)于RPMI1640+10%胎牛血清+4 μg/mL的ADR培養(yǎng)液中，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗前1周，K562/ADR細胞培養(yǎng)液更換為不含ADR的培養(yǎng)液。實驗時取對數(shù)生長期K562細胞、K562/ADR細胞接種于96孔板，調整至每孔細胞數(shù)為5×103個。實驗分為2組：K562細胞組(分別加入0、0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的 ADR)、K562/ADR細胞組(分別加入0、16、32、64、128 μg/mL的ADR)。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個濃度設5個平行復孔，每孔加入10 μL 的CCK溶液，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，并計算ADR的IC50，K562/ADR細胞對ADR的耐藥倍數(shù)=K562/ADR細胞組IC50/K562細胞組IC50。

1.3 芍藥苷對K562/ADR細胞的細胞毒性測算 采用CCK-8法檢測。將對數(shù)生長期K562/ADR細胞接種于96孔板，調整至每孔細胞數(shù)為5×103個。將K562/ADR細胞分為2組：空白對照組(加入等量DMSO)、實驗組(分別加入2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍藥苷100 μL)，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用酶標儀測定各組吸光度值。K562/ADR細胞增殖抑制率=(1-實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100%。選擇用于后續(xù)實驗的芍藥苷濃度應無明顯細胞毒性，即細胞增殖抑制率<10%。

1.4 加入芍藥苷后ADR對K562/ADR細胞的IC50測算 采用CCK-8法檢測。將對數(shù)生長期K562/ADR細胞接種于96孔板，調整至每孔細胞數(shù)為4×105個。將K562/ADR細胞分為A、B、C三組，每組設5個復孔。A組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR；B組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入2 μmol/L的芍藥苷；C組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入4 μmol/L的芍藥苷。三組均置無菌培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，用酶標儀測定各組吸光度值，計算ADR的IC50。B、C組的逆轉倍數(shù)=A組IC50/B組IC50或C組IC50。

1.5 加入芍藥苷后K562/ADR細胞內ADR濃度變化觀察 將對數(shù)生長期K562/ADR細胞接種于96孔板，調整至每孔細胞數(shù)為1×105個。將K562/ADR細胞分為a、b、c三組，a組加入3 μg/mL 的ADR；b組加入3 μg/mL 的ADR和2 μmol/L的芍藥苷；c組加入3 μg/mL的 ADR和4 μmol/L的芍藥苷。常規(guī)避光培養(yǎng)1 h，以750 g離心5 min，PBS洗滌去除游離ADR。流式細胞儀檢測485/580 nm波長處ADR熒光強度，即細胞內ADR濃度。

1.6 加入芍藥苷后K562/ADR細胞中多藥耐藥相關蛋白MRP1、MAPK信號通路蛋白p38和磷酸化p38(p-p38)檢測 采用Western blotting法。將“1.5”中a、b、c三組的K562/ADR細胞置于不同離心管，離心后收集細胞，PBS洗滌，加入100 μL的蛋白裂解液，離心后提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測各受檢蛋白濃度。配制8%的SDS-PAGE凝膠，每孔加入50 μg蛋白樣品，將蛋白質電泳并反轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶+0.2% Tween20封閉2 h，與特異性抗體4 ℃孵育過夜。次日，室溫下用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶5 000)密封PVDF膜2 h,暗室中分別顯影、定影，將膠片用掃描儀掃描至電腦，并用Image J軟件進行受檢蛋白光密度值分析。受檢蛋白相對表達量=受檢蛋白光密度值/內參蛋白光密度值×100%。

2 結果

2.1 ADR對K562/ADR細胞、K562細胞的IC50比較 ADR對 K562/ADR細胞、K562細胞的IC50分別為(48.37±2.10)、(1.47±0.36)μg/mL，兩者相比，P<0.05。K562/ADR細胞對ADR的耐藥倍數(shù)為32.91倍。

2.2 芍藥苷對K562/ADR細胞的細胞毒性比較 2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍藥苷對K562/ADR細胞的增殖抑制率分別為2.67%±0.82%、9.20%±1.32%、18.94%±1.84%、30.62%±1.73%、44.13%±2.28%、61.38%±2.68%、74.68%±3.98%、85.39%±5.12%，兩兩相比，P均<0.05。芍藥苷濃度為2、4 μmol/L時，對K562/ADR細胞無明顯細胞毒性(細胞增殖抑制率小于10%)。

2.3 加入芍藥苷后ADR對K562/ADR細胞的IC50比較 A、B、C組ADR對K562/ADR細胞的IC50分別為(29.97±1.72)、(20.03±0.75)、(13.78±0.63)μg/mL，兩兩相比，P均<0.05。B、C組對ADR的逆轉倍數(shù)分別為1.51、2.17，逆轉倍數(shù)與芍藥苷的濃度呈正相關(r=0.43，P<0.05)。

2.4 加入芍藥苷后K562/ADR細胞內ADR濃度變化 a、b、c組熒光強度分別為320±14、676±62、883±28，兩兩相比，P均<0.05。

2.5 加入芍藥苷后K562/ADR細胞中MRP1、p38、p-p38蛋白的表達比較 a、b、c組中MRP1蛋白的相對表達量分別為87.69%±1.54%、80.95%±4.10%、67.72%±5.98%，兩兩相比，P均<0.05； p38蛋白的相對表達量分別為66.7%±1.22%、60.18%±2.78%、59.82%±4.02%，兩兩相比，P均>0.05；p-p38蛋白的相對表達量分別為72.43%±2.67%、63.18%±2.32%、52.23%±6.02%，兩兩相比，P均<0.05。

3 討論

本實驗首先觀察了K562/ADR細胞對ADR的穩(wěn)定耐藥性，并檢測了芍藥苷對K562/ADR細胞的細胞毒性，按照細胞增殖抑制率<10%的標準，選擇2 μmol/L、4 μmol/L濃度的芍藥苷用于后續(xù)實驗。實驗結果顯示，芍藥苷在無毒劑量下可明顯增強ADR對K562/ADR細胞的細胞毒性,且逆轉效果與芍藥苷的濃度呈正相關。同時，實驗還檢測了加入芍藥苷后K562/ADR細胞內ADR濃度變化情況，結果顯示，加入芍藥苷后K562/ADR細胞內ADR濃度顯著升高，說明芍藥苷可通過增加K562/ADR細胞內ADR藥物濃度起到逆轉多藥耐藥的作用。

實驗還對多藥耐藥相關蛋白MRP1、MAPK信號通路蛋白p38和p-p38蛋白的表達進行了檢測，結果顯示，加入芍藥苷后K562/ADR細胞中MRP1、p-p38蛋白的表達水平顯著下降。多藥耐藥相關蛋白MRP1蛋白屬于ATP結合盒膜轉運子家族成員，是化療藥物作用于腫瘤細胞的關鍵屏障。MRP1可阻止藥物作用于靶細胞，從而降低腫瘤細胞的藥物敏感性[10～12]。MRP1在多種腫瘤細胞中呈高表達，可導致化療藥物治療失敗[13，14]。本研究結果表明，與不含芍藥苷組比，ADR與芍藥苷聯(lián)用組MRP1的表達明顯降低，MRP1的表達下降增加了K562/ADR細胞內ADR的濃度。p38是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的一員，具有多種生物活性，如促進細胞增殖、分化，促進炎癥介質合成、釋放等[15～18]。p38 MAPK信號通路活化標志為p-p38。研究[19，20]顯示，p38 MAPK信號通路在CML的多藥耐藥產(chǎn)生中具有重要作用。同時，p38 MAPK信號通路可以調節(jié)MRP1的蛋白表達水平[21]。本研究結果表明，經(jīng)芍藥苷處理24 h后，p38蛋白表達水平未見明顯改變，而p-p38表達水平明顯降低，即p38活性降低，表明芍藥苷通過p38 MAPK通路抑制MRP1蛋白表達。

綜上，芍藥苷能逆轉K562/ADR細胞對ADR的耐藥性，逆轉作用與抑制P38 MAPK信號通路及下調MRP1蛋白表達有關。本研究為臨床應用芍藥苷治療CML奠定了實驗基礎。