趙含笑，于天啟

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣州510378)

多發(fā)性骨髓瘤是由于漿細(xì)胞惡性克隆，合成和分泌結(jié)構(gòu)單一的單克隆免疫球蛋白(M蛋白)和(或)其輕鏈，并伴有正常免疫球蛋白減少的惡性腫瘤。糖皮質(zhì)激素對淋巴細(xì)胞具有溶解作用，地塞米松可以通過多種通路誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的凋亡。中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2017版)推薦，無論初始治療還是復(fù)發(fā)以及原發(fā)耐藥多發(fā)性骨髓瘤，均首選包含地塞米松的化療方案[3]。隨著蛋白酶體抑制劑(如硼替佐米)、免疫調(diào)節(jié)劑(如來那度胺)的出現(xiàn)以及應(yīng)用，多發(fā)性骨髓瘤患者的中位生存期有所提高。然而在現(xiàn)有的治療方法下，大多數(shù)患者還是不可避免地進(jìn)展為復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤[4]。Wnt通路與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長、發(fā)育、遷移有關(guān)，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中被異常激活。Wnt通路被激活后，糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)活性受到抑制，使β-catenin在核內(nèi)聚集，激活下游靶基因如c-Myc和cyclin D1，促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖。研究[5]認(rèn)為，影響β-catenin或GSK-3β的基因蛋白表達(dá)可能是多發(fā)性骨髓瘤治療的新方法。多發(fā)性骨髓瘤屬中醫(yī)“骨痹”“骨蝕”“虛勞”等范疇，以脾虛虧虛、痰瘀濕毒為病機(jī)。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，黃芩苷是黃芩中的有效成分之一，具有抑制急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長[6]、降低阿霉素耐藥性[7]的作用。2018年3月31日～2018年8月31日，我們觀察了不同濃度的黃芩苷對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266增殖、凋亡、侵襲及β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑及儀器 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266購自武漢普諾賽生命科技有限公司。黃芩苷(95%)、地塞米松(標(biāo)準(zhǔn)品)、BCA蛋白定量試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素混合液(100×)、胎牛血清、PBS緩沖液購自Gibco公司，CCK-8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所，Annexin-V/PI雙染試劑盒購自貝博生物，柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程股份有限公司，cDNA kit購自Thermo Scientific公司，F(xiàn)ast SYBR Mixture(High ROX)購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，脫脂奶粉購自美國BD公司，Anti-beta Catenin抗體、Anti-GSK3(alpha+beta)抗體購自Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈操作臺購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，流式細(xì)胞儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司

1.2 細(xì)胞分組及黃芩苷給予方法 ①黃芩苷對U266細(xì)胞半抑制濃度(IC50)的檢測：U266細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長至80%～95%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。收集對數(shù)期U266細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別用濃度為2、4、8、16、32 μmol/L黃芩苷培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，對照組加入不含黃芩苷的培養(yǎng)基，分別接種于96孔板，調(diào)整為每孔細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算各濃度細(xì)胞增殖抑制率。通過Graph Pad Prism 6計(jì)算可得，24、48、72 h黃芩苷對U266細(xì)胞的IC50值分別為45.63、18.28、6.12 μmol/L，呈時(shí)間和濃度依賴性。取48 h的黃芩苷對U266細(xì)胞的IC50值18.28 μmol/L為最佳濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②細(xì)胞分組及黃芩苷給予方法：將U266細(xì)胞分為4組，空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基、地塞米松組加入地塞米松、黃芩苷組加入黃芩苷、地塞米松+黃芩苷組加入地塞米松和黃芩苷，分別培養(yǎng)。

1.3 各組細(xì)胞增殖抑制率測算 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h時(shí)，采用CCK-8法檢測各組OD值，以O(shè)D值反映各組細(xì)胞增殖抑制情況。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，用Annexin-V/PI雙染試劑染色后流式細(xì)胞儀檢測，調(diào)試電壓和熒光補(bǔ)償后，畫十字門，記錄各組十字門的第四象限細(xì)胞百分比，以第四象限細(xì)胞百分比表示各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞培養(yǎng)12 h時(shí)，結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取不同視野，計(jì)數(shù)結(jié)晶紫染色的穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示各組細(xì)胞侵襲能力。

1.6 各組細(xì)胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA檢測 采用RT-PCR法。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，提取各組的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，參照PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：β-catenin上游引物為5′-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3′，下游引物為5′-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3′；GSK3β上游引物為5′-AGACGCTCCCTGTGATTTATGT-3′，下游引物為5′-CCGATGGCAGATTCCAAAGG-3′；c-Myc上游引物為5′-GTCAAGAGGCGAACACACAAC-3′，下游引物為5′-TTGGACGGACAGGATGTATGC-3′；cyclin D1上游引物為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游引物為5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；GAPDH上游引物為5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物為5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72℃ 20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct表示各組細(xì)胞中β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1的mRNA相對表達(dá)量。

1.7 各組細(xì)胞β-catenin、GSK3β蛋白檢測 采用Western blotting法。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，分別提取細(xì)胞總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為1 g/L，煮蛋白變性，取20 μL蛋白樣品于電泳槽中電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入各蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入脫脂牛奶標(biāo)記的二抗，室溫孵育后洗滌3次，化學(xué)發(fā)光顯色后，Image J軟件計(jì)算各組細(xì)胞β-catenin、GSK3β蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值比較 培養(yǎng)24 h時(shí)，空白組、地塞米松組、黃芩苷組、地塞米松+黃芩苷組的OD值分別為0.33±0.01、0.29±0.01、0.30±0.01、0.27±0.02，地塞米松+黃芩苷組與空白組相比，P<0.05；其余各組間相比，P均>0.05。培養(yǎng)48 h時(shí)，空白組、地塞米松組、黃芩苷組、地塞米松+黃芩苷組的OD值分別為0.57±0.02、0.42±0.02、0.49±0.01、0.36±0.02，組間相比，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h時(shí)，空白組、地塞米松組、黃芩苷組、地塞米松+黃芩苷組細(xì)胞凋亡率分別為5.4%、17.8%、13.8%、30.5%，黃芩苷組與地塞米松組相比，P>0.05；其余各組間相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 培養(yǎng)12 h時(shí)，空白組、地塞米松組、黃芩苷組、地塞米松+黃芩苷組每個(gè)鏡下穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(99±8.19)、(88.33±6.11)、(87.67±2.08)、(32.67±3.5)個(gè)，黃芩苷組與地塞米松組相比，P>0.05；其余各組間相比，P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞β-catenin、GSK3β、c-Myc、cyclin D1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白組相比，﹡P<0.05；與地塞米松組相比，﹟P<0.05；與黃芩苷組相比，△P<0.05。

3 討論

溶骨性骨病變或骨質(zhì)減少是多發(fā)性骨髓瘤的病理特征之一,近90%的多發(fā)性骨髓瘤患者會發(fā)生骨質(zhì)溶解性骨病變，常伴有嚴(yán)重骨痛、病理性骨折、椎體塌陷、高鈣血癥、脊髓受壓等與骨骼相關(guān)的事件。溶骨性骨病變是破骨細(xì)胞激活和成骨細(xì)胞抑制的結(jié)果，打破了破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在正常組織中形成的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致骨重塑改變。在多發(fā)性骨髓瘤中，破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增加，而成骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子抑制骨形成。因此，以成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞為靶點(diǎn)的新型藥物不僅是治療多發(fā)性骨髓瘤溶骨性病變的一種很有研究價(jià)值的治療策略，也是治療多發(fā)性骨髓瘤的一種頗具前途的治療新策略[8]。研究[9]顯示，黃芩苷在低濃度(低于1 μmol/L)下可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化成熟、增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化和骨吸收，而在高濃度(高于2 μmol/L)時(shí)對破骨細(xì)胞有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷可抑制U266細(xì)胞的增殖；黃芩苷能夠誘導(dǎo)U266細(xì)胞的凋亡，并增加地塞米松對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；經(jīng)黃芩苷干預(yù)后下室穿膜細(xì)胞數(shù)減少，作用效果與地塞米松類似。

Wnt 信號通路在組織和器官的穩(wěn)態(tài)維持和修復(fù)方面至關(guān)重要，與多種腫瘤有關(guān)，同時(shí)對骨形成和骨重建有重要作用。有研究[10]表明，黃芩苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的活性。黃芩苷可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化成熟，提高β-catenin、GSK-3β的mRNA水平,并提高β-catenin蛋白表達(dá)量。黃芩苷可顯著增加成骨細(xì)胞的成骨礦化和編碼骨分化標(biāo)志物的mRNA水平,通過激活Wnt通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,激活GSK3β，進(jìn)而誘導(dǎo)β-catenin的核積累，激活下游靶向基因轉(zhuǎn)錄，并可間接調(diào)控破骨細(xì)胞的活化。綜上所述，黃芩苷可通過調(diào)節(jié)Wnt通路調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖分化，治療和預(yù)防溶骨性骨病變及骨質(zhì)疏松，從而達(dá)到間接治療多發(fā)性骨髓瘤的目的。但目前尚未證實(shí)黃芩苷可以直接作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和地塞米松均可下調(diào)Wnt通路調(diào)節(jié)分子β-catenin、GSK3β及下游靶基因c-Myc、cyclin D1 mRNA的表達(dá)；黃芩苷和地塞米松聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可下調(diào)β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá)量，但黃芩苷、地塞米松單獨(dú)應(yīng)用時(shí)則不能。

目前認(rèn)為，β-caetnin是Wnt信號傳導(dǎo)通路的正向調(diào)節(jié)因子，而GSK3β是負(fù)向調(diào)節(jié)因子[11]。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷干預(yù)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞后，β-caetnin和GSK3β mRNA的表達(dá)均下調(diào)，黃芩苷和地塞米松聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，也可下調(diào)β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá)量，與其他研究結(jié)論不完全相符。目前尚缺乏血液系統(tǒng)疾病尤其是多發(fā)性骨髓瘤各細(xì)胞系經(jīng)Wnt通路抑制劑或中藥單體干預(yù)后對Wnt通路中β-catenin、GSK3β的mRNA及蛋白表達(dá)的影響的研究，尚需接下來進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。另外，是否由于黃芩苷對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞Wnt經(jīng)典通路起到雙向調(diào)節(jié)作用，使其在誘導(dǎo)凋亡過程中β-catenin、GSK3β的mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)亦需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，黃芩苷可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，作用效果與地塞米松類似，黃岑苷與地塞米松聯(lián)用時(shí)有協(xié)同作用。黃岑苷與地塞米松聯(lián)用時(shí)，可下調(diào)Wnt通路調(diào)節(jié)分子β-catenin、GSK3β及下游靶基因c-Myc、cyclin D1 mRNA的表達(dá)，還可下調(diào)β-catenin、GSK3β蛋白表達(dá)量。黃芩苷與地塞米松可能通過Wnt通路及其下游因子調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。