王莉，賀濤，馮世杰，萬百順，王效謙，張珉，張玲，韓風(fēng)

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)可影響細(xì)胞的分化、增殖及腫瘤發(fā)生，目前已被公認(rèn)為是一種有助于診斷和判斷原發(fā)性肝癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，70%的肝癌患者血清高表達(dá)AFP[1，2]。肝癌細(xì)胞系EGHC-9901是近些年構(gòu)建的細(xì)胞系，可形成完整毛細(xì)膽管且有明顯微絨毛，能持續(xù)高分泌AFP，細(xì)胞變異較小，是體外研究AFP功能的良好生物學(xué)模型[3]。我們在前期研究中利用能持續(xù)高分泌AFP的肝癌細(xì)胞系EGHC-9901建立了穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞模型，探討了沉默AFP基因?qū)ζ渖L凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制[4，5]。2017年4月1日～2018年5月30日，我們觀察了AFP基因沉默對肝癌細(xì)胞遷移黏附能力的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 肝癌細(xì)胞系EGHC-9901(前期實(shí)驗(yàn)[4，5]中，我們采用脂質(zhì)體法已獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EGHC-9901細(xì)胞，Western blotting法及RT-PCR法檢測AFP蛋白及基因確證轉(zhuǎn)染成功)由山東大學(xué)提供。G418、RT-PCR試劑盒、TRIzol、DMEM培養(yǎng)液干粉及胎牛血清購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，AFP小鼠抗人單克隆抗體及E-鈣黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附轉(zhuǎn)移相關(guān)分子抗體購自BD公司(英國)。核酸及蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀購自BIO-RAD公司(美國)，臺式冷凍離心機(jī)購自Sigma公司(美國)，PE2400型 PCR儀購自PE公司(美國)，凝膠圖像分析系統(tǒng)購自UVP公司(美國)，CO2培養(yǎng)箱購自NACPO公司(美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及AFP基因沉默 pSilencer3.0-H1-AFP重組質(zhì)粒(用于沉默AFP基因)的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[6]，DNA瓊脂糖凝膠電泳及Ml3的通用引物測序表明，該質(zhì)粒大小與陽性質(zhì)控質(zhì)粒相同，插入片段的序列與已合成的寡核苷酸的序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有插入、缺失及突變等異常。EGHC-9901細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(添加相應(yīng)的青霉素-鏈霉素等)中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。取生長良好的對數(shù)生長期EGHC-9901細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將EGHC-9901細(xì)胞分為3組：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pSilencer3.0-H1-AFP質(zhì)粒、載體對照組轉(zhuǎn)染空載體、空白對照組未做任何處理。

1.3 各組細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。Transwell小室置入24孔培養(yǎng)板,形成上下兩個小室。各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后重懸于無血清0.5% BSA DMEM培養(yǎng)基，配制濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液,取100 μL細(xì)胞懸液加入上層小室,下層小室加胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后,以甲醇固定Transwell膜，結(jié)晶紫染色。洗脫膜表面的細(xì)胞并用中性樹膠封閉于玻片中，鏡下觀察穿膜細(xì)胞并拍照，隨機(jī)選取5～8個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞同質(zhì)黏附能力檢測 采用細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞經(jīng)HCMF洗滌及胰蛋白酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105/mL，按每孔500 μL細(xì)胞懸液加入到BSA包被好的24孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于空氣振蕩器上，80 rpm分別振搖20 min、40 min、60 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并統(tǒng)計(jì)聚集細(xì)胞數(shù)及單個細(xì)胞數(shù)。通過計(jì)算細(xì)胞聚集指數(shù)(aggregation index，AI)來衡量細(xì)胞同質(zhì)黏附能力。AI=(N0-Nt)/N0，其中N0為細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)開始前總細(xì)胞數(shù)(包括單個細(xì)胞與聚集細(xì)胞)，Nt為特定時間后總細(xì)胞數(shù)(包括單個細(xì)胞與聚集細(xì)胞)。

1.5 各組細(xì)胞異質(zhì)黏附能力檢測 采用層黏連蛋白黏附實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞經(jīng)0.1%膠原酶溶液消化，制備細(xì)胞懸液，加入到層黏連蛋白包被的96孔培養(yǎng)板，每孔加l×106個細(xì)胞，設(shè)PBS孔作空白對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于30 min、60 min、90 min時提取細(xì)胞，CCK-8試劑盒避光染色2 h，490 nm處檢測各組OD值，以O(shè)D值反映細(xì)胞異質(zhì)黏附能力。

1.6 各組細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達(dá)檢測 采用Western blotting法。各組細(xì)胞采用改良lorry法進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，依此作為回歸方程計(jì)算待測樣品濃度。經(jīng)β-巰基乙醇加熱處理后上樣， 5%濃縮膠電泳40～60 min。在PVDF膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉，敷封閉液稀釋的細(xì)胞黏附蛋白AFP小鼠抗人一抗，4 ℃過夜，PBST洗膜，敷封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫靜置4 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)檢測黏附蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以受檢蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞遷移能力比較 實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組每個鏡下穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(132±16)個、(335±21)個、(371±32)個，實(shí)驗(yàn)組與載體對照組、空白對照組相比，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞同質(zhì)黏附能力比較 實(shí)驗(yàn)組鏡下可見大量的細(xì)胞團(tuán)塊狀組織，而載體對照組及空白對照組可見大量散在的細(xì)胞及小的細(xì)胞團(tuán)塊。

振搖時間20 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.263±0.010、0.216±0.013、0.220±0.009，組間相比，P均>0.05。振搖時間40 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.530±0.020、0.223±0.017、0.240±0.012，實(shí)驗(yàn)組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。振搖時間60 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.632±0.031、0.322±0.021、0.376±0.019，實(shí)驗(yàn)組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞異質(zhì)黏附能力比較 培養(yǎng)30 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.225±0.014、0.223±0.018、0.267±0.020，組間相比，P均>0.05。培養(yǎng)60 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.157±0.008、0.347±0.026、0.363±0.039，實(shí)驗(yàn)組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。培養(yǎng)90 min時，實(shí)驗(yàn)組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.139±0.010、0.476±0.023、0.503±0.045，實(shí)驗(yàn)組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達(dá)比較

注：與空白對照組相比，﹡P<0.05；與載體對照組相比，﹟P<0.05。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的遷移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程， 其中腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜黏附、腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)和血管基膜、腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移是轉(zhuǎn)移過程中的三個重要步驟，包括蛋白降解酶、腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移以及腫瘤細(xì)胞的黏附[7]。細(xì)胞合適的遷移黏附是機(jī)體維持正常的生命活動與防御機(jī)制所必須的，但遷移黏附能力的異常改變是導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素[8]。腫瘤細(xì)胞自身黏附能力，即同質(zhì)黏附能力的減弱將會導(dǎo)致腫瘤的播散；腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)等黏附能力，即異質(zhì)黏附能力的增強(qiáng)則會導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力、同質(zhì)黏附能力以及異質(zhì)黏附能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFP基因沉默可抑制肝癌細(xì)胞遷移，促進(jìn)肝癌的同質(zhì)黏附能力，抑制細(xì)胞異質(zhì)黏附能力。

黏附能力的改變主要由細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)[10]。細(xì)胞黏附分子本質(zhì)上是細(xì)胞膜上的一類跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及實(shí)質(zhì)器官組織細(xì)胞或其它腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，包括免疫球蛋白超家族、 整合素家族、 選擇素家族和血管附著素家族黏附分子以及鈣黏素家族等。與原發(fā)性肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的主要黏附分子包括E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15等[11]。E-鈣黏蛋白與肝癌的分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及病情發(fā)展密切相關(guān)[12];E-鈣黏蛋白的低表達(dá)或缺失往往提示肝癌侵襲能力強(qiáng)，分化程度低，且容易經(jīng)淋巴結(jié)或血液轉(zhuǎn)移[13]。CD44V6是一種細(xì)胞表面黏附分子，主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的特異性黏連，參與細(xì)胞偽足的形成，引起細(xì)胞的形態(tài)和游動性改變，直接參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；CD44V6在正常肝臟組織或良性肝臟腫瘤往往低表達(dá)，而在肝臟惡性腫瘤中則往往高表達(dá)，并且表達(dá)的高低與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)[14]。整合素家族是一組介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的跨膜糖蛋白，參與跨膜信息系統(tǒng)，影響細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)與調(diào)控以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等[15]。β-連環(huán)素是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和細(xì)胞間黏附分子,是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，并是構(gòu)成黏附連接的E-cd/cat復(fù)合體的胞內(nèi)重要成分,并通過與多種蛋白的結(jié)合參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[16]。CD15 是細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂含有的外鏈巖藻糖化的乙酰乳糖胺糖鏈，作為細(xì)胞黏附分子成員，可通過結(jié)合含有選凝素的血小板、粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。本研究檢測了轉(zhuǎn)染前后E-鈣黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附轉(zhuǎn)移相關(guān)分子表達(dá)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整合素β1蛋白表達(dá)量升高、CD15蛋白表達(dá)量降低，提示AFP可能通過調(diào)節(jié)黏附蛋白整合素β1、CD15的表達(dá)調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移黏附能力。

綜上，AFP基因沉默表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞遷移，促進(jìn)肝癌的同質(zhì)黏附能力，抑制細(xì)胞異質(zhì)黏附能力。AFP可能通過調(diào)節(jié)黏附分子整合素β1、CD15的表達(dá)調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移黏附能力。