梁君偉，李青山，呂喜英，連相堯，劉蘭芳，方志華

(1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2 承德市第三醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升，并且呈現(xiàn)明顯年輕化趨勢，發(fā)病率位居城市女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅女性健康和生活質(zhì)量[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明，盡管手術(shù)和術(shù)后輔助治療取得明顯進步，乳腺癌患者的預(yù)后有了一定的改善，但乳腺癌仍具有較高的復(fù)發(fā)率[2]。近年來國內(nèi)外研究[3]表明，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有明顯抗腫瘤活性。體內(nèi)及體外實驗證實其能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲、遷移能力，使其成為目前腫瘤學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點，但二甲雙胍抗乳腺癌方面的研究較少，并且作用機制尚不清楚。第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是目前公認(rèn)的抑癌基因之一，在包括乳腺癌在內(nèi)的眾多腫瘤中均起著明確的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[4]。研究[5，6]表明，上調(diào)PTEN基因的表達(dá)水平能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，并促進其凋亡。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，許多藥物或化學(xué)合成物能夠通過提高PTEN的表達(dá)水平從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究觀察不同濃度的二甲雙胍對人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3增殖、凋亡、侵襲及PTEN表達(dá)水平的影響，并探討二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 二甲雙胍、細(xì)胞及試劑 二甲雙胍原藥粉劑購自美國Sigma公司。人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3購自美國ATCC公司。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司，PTEN及內(nèi)參β-actin引物購自廣州銳博生物公司， CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，一抗PTEN、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SK-BR-3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，細(xì)胞呈單層貼壁生長，待融合度達(dá)90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 各組細(xì)胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SK-BR-3細(xì)胞接種于96孔板，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞。將SK-BR-3細(xì)胞分成4組，每組設(shè)5個平行孔，分別加入0、5、10、20 mmol/L的二甲雙胍，記為0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組。各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀測定波長450 nm 處的OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-各組OD值450nm)/0 mmol/L組OD值450nm×100%。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混合均勻后再加入5 μL PI，室溫避光反應(yīng)10 min后流式細(xì)胞儀檢測，計算各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實驗。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。Matrigel膠4 ℃過夜融化，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1:8稀釋后，均勻涂抹至Transwell小室上室的通透膜。取各組細(xì)胞制備的單細(xì)胞懸液，于Transwell小室上室分別加入200 μL含有2×105個細(xì)胞的無血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，倒置、室溫風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機取10個視野，計算穿過通透膜的細(xì)胞數(shù)目，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.6 各組細(xì)胞PTEN mRNA檢測 采用qRT-PCR法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，應(yīng)用TRIzol試劑按說明書操作提取細(xì)胞總RNA，取5 ng總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增。引物序列：PTEN上游引物為5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游引物為5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTA-GCCAACTGC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。用2-△△Ct表示各組細(xì)胞中PTEN mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 各組細(xì)胞PTEN蛋白檢測 采用Western blotting法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細(xì)胞，應(yīng)用預(yù)冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min后提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組細(xì)胞蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，分別加入合適濃度的一抗PTEN單克隆抗體(濃度1∶1 000)或β-actin單克隆抗體(濃度1∶3 000)，4 ℃搖床輕搖孵育過夜，漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(濃度1∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、壓片、灰度掃描，以灰度值表示PTEN蛋白的相對表達(dá)水平，以β-actin 校正。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.0%±0.0%、23.7%±2.2%、43.2%±2.9%、63.9%±5.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且細(xì)胞增殖抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為5.1%±0.2%、18.2%±1.9%、26.3%±2.0%、40.1%±2.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細(xì)胞凋亡有明顯的促進作用，且細(xì)胞凋亡促進作用具有一定的濃度依賴性。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(170±23)個、(112±14)個、(74±9)個、(30±5)個，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細(xì)胞侵襲能力有明顯的抑制作用，且細(xì)胞侵襲能力抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.4 各組細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞PTEN mRNA的相對表達(dá)量分別為1.01±0.04、2.89±0.27、4.12±0.23、5.45±0.49，PTEN蛋白的相對表達(dá)水平分別為0.13±0.05、0.41±0.06、0.61±0.10、0.94±0.11，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍能夠上調(diào)SK-BR-3細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，且表達(dá)上調(diào)作用具有一定的濃度依賴性。

3 討論

研究[9]顯示，胰島素抵抗和高血糖癥明顯增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險，特別是對于絕經(jīng)后合并體質(zhì)量超重的患者。研究[10]表明，合并糖尿病的乳腺癌患者生存期明顯短于未合并糖尿病的患者。二甲雙胍是目前臨床廣泛應(yīng)用的治療2型糖尿病的一線降糖藥物。近年來研究[11]證實,二甲雙胍可降低2型糖尿病患者腫瘤發(fā)病風(fēng)險及腫瘤相關(guān)死亡率。在乳腺癌的研究[12]中也證實，二甲雙胍可降低2型糖尿病患者乳腺癌的發(fā)病率。Jiralerspong等[13]發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的乳腺癌患者，服用二甲雙胍患者的預(yù)后明顯優(yōu)于未服用二甲雙胍者，但至今二甲雙胍對乳腺癌發(fā)生及預(yù)后影響的具體作用機制尚未明確。

乳腺細(xì)胞的異常增生、凋亡受阻、侵襲增強是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的主要因素。抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，是目前藥物治療惡性腫瘤重要的作用機制之一。近年有研究[14]證實，二甲雙胍能夠抑制腫瘤生長和增殖，并且能夠減小荷瘤裸鼠的腫瘤體積，且對機體正常細(xì)胞不產(chǎn)生破壞作用，在抗腫瘤方面具有很大的應(yīng)用前景，引起了學(xué)者的關(guān)注。但二甲雙胍對乳腺癌生長、侵襲影響的研究較少。本研究用不同濃度的二甲雙胍處理人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞后，檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍對SK-BR-3細(xì)胞的增殖和侵襲有著明顯的抑制作用，對SK-BR-3細(xì)胞的凋亡有著明顯的促進作用，提示二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞的生長有著明顯抑制作用，并且這些作用都具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強。

目前有關(guān)二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞生長侵襲抑制作用的具體作用機制尚不清楚。近年研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在胃癌、腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中可以上調(diào)PTEN的表達(dá)而發(fā)揮抑癌基因的作用。PETN基因位于染色體10q2313上，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，是至今發(fā)現(xiàn)的惟一具有磷酸酶活性和蛋白脂酶活性的抑癌基因。研究[17]發(fā)現(xiàn),PETN能夠通過調(diào)控PI3K/AKT、FAK/P130CAS、SHC/Gab、P53/MDM2、PRAP/mTOR、RAS/ERK等機體多個重要信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)控。研究[18]顯示，50%的乳腺癌患者存在PTEN基因缺失、突變或者啟動子甲基化。Stambolic等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，條件性敲除PTEN基因的雌性小鼠，49%在6個月后發(fā)生乳腺癌。提高乳腺癌細(xì)胞PTEN基因的表達(dá)水平能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移，并促進其凋亡[20]。在對耐藥性乳腺癌細(xì)胞的研究[21]中發(fā)現(xiàn)，提高PTEN基因的表達(dá)可以明顯提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物阿霉素的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，并且對PTEN mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)作用具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強，說明二甲雙胍能夠通過上調(diào)PTEN基因的表達(dá)水平發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞生長侵襲的作用。

綜上所述，二甲雙胍能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進其凋亡，對乳腺癌細(xì)胞的生長起著明顯的抑制作用，并且抑制作用與二甲雙胍濃度有關(guān)，其機制可能與上調(diào)PTEN的表達(dá)有關(guān)。