沈益飛, 張云坤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 常州, 213003)

1988年 Rothberg等[1]發(fā)現(xiàn)果蠅的中樞神經(jīng)中線膠質(zhì)細(xì)胞可合成Slit蛋白，其缺乏可導(dǎo)致縱行傳導(dǎo)通路和交叉(聯(lián)合)神經(jīng)元軸突在中線發(fā)生聚集異常。1998年, Kidd等[2]首次提出Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受體，為進(jìn)一步研究Slit蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。Slit-Robo通路包括Slit分泌蛋白家族(Slit1、2、3)及其特異性受體(Robo1、2、3、4), 其中Slit2/Robo1信號通路最初發(fā)現(xiàn)是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[3-5], 深入研究[6-8]發(fā)現(xiàn)Slit2與Robo1相互作用還可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化性、中胚層的遷移以及血管平滑肌細(xì)胞的遷移。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn), Slit2和Robo1的相互作用可以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。研究[9-10]表明, Slit2和Robo1的啟動子在幾種不同類型的癌癥中是高甲基化的, Slit2/Robo1參與多種不同的腫瘤細(xì)胞活動過程，比如增殖和遷移。本研究對Slit2/Robo1在不同腫瘤中的作用綜述如下。

1 Robo1、Slit2基因及結(jié)構(gòu)特征

人類Robo1基因位于人染色體的3p12.3, 其編碼跨膜蛋白受體。Robo1蛋白包含5個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域, 3個纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域, 1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)片段。其細(xì)胞內(nèi)區(qū)包含4個特定的保守基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。Robo1胞外的IgG結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是與配體Slit2結(jié)合所必需的，胞內(nèi)區(qū)域則和一些重要的信號分子相互作用，參與Slit/Robo下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而完成刺激信號由細(xì)胞外部至內(nèi)部骨架的傳遞[11]。

Slit2基因定位于人染色體4p15.2, 編碼人類與果蠅 Slit2 同源的細(xì)胞外基質(zhì)分泌性糖蛋白，是 Slit 基因家族(Slit1～3)的一員，其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向和神經(jīng)細(xì)胞的遷移[12]。Slit2蛋白的結(jié)構(gòu)包括1個信號肽、4個獨特的富含亮氨酸重復(fù)單位(LLR)D1-D4, 其后連接9個類似表皮生長因子(EGF)重復(fù)區(qū)(果蠅為7個), 1個群集層黏連蛋白-基底膜蛋白多糖-Slit的保守隔離模體, 1個富含半胱氨酸區(qū)。LLR區(qū)為與Robo1相互作用及軸突導(dǎo)向作用所必需, EGF重復(fù)區(qū)和Slit的彌散有關(guān)，模體具有調(diào)節(jié)蛋白-蛋白、基質(zhì)-蛋白的相互作用的功能[13-14]。

2 Slit2/Robo1與腦膠質(zhì)瘤

鑒于Slit2/Robo1信號通路在神經(jīng)發(fā)育過程中起著重要作用，研究人員最早將目光投向了其在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的作用。腦膠質(zhì)瘤組織中的Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化，是導(dǎo)致Slit2的表達(dá)下調(diào)的主要原因[15]。Li等[16]通過表達(dá)譜分析對比正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Slit2和Robo1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Slit2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量明顯低于正常組織，且隨著腫瘤分級的升高而逐漸降低，而Robo1的在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，預(yù)后生存分析Slit2、Robo1均陽性表達(dá)的患者生存率明顯優(yōu)于Slit2陰性表達(dá)、Robo1陽性表達(dá)患者。在腦膠質(zhì)瘤中, Slit2的表達(dá)與Robo1的表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)性, Slit2的低表達(dá)和Robo1的高表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤的侵襲性、惡性進(jìn)展以及不良預(yù)后有著密切的關(guān)系，且Slit2的表達(dá)缺失和Robo1表達(dá)增高可能具有協(xié)同作用，二者的差異表達(dá)共同促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的生成，在膠質(zhì)瘤的發(fā)病以及進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

Slit2/Robo1影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機制目前并未明確。Jean J等[17]發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中, Slit2的表達(dá)量較正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞均有明顯下調(diào)，通過體內(nèi)外實驗證明Slit2通過其受體Robo1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Cdc42的活性，從而通過抑制Cdc42-GTP活性來特異性地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。最新研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro-RNA)可以通過Slit2/Robo1信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。JIAN等[18]發(fā)現(xiàn), microRNA218(mi-218)的過表達(dá)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Slit2的表達(dá)，同時降低Robo1的表達(dá)，從而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲力。

3 Slit2/Robo1與消化系統(tǒng)腫瘤

3.1 Slit2/Robo1與食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌

Ruo-Chia等[19]通過免疫組織化學(xué)、甲基化測序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中Slit2啟動子高甲基化，導(dǎo)致Slit2蛋白表達(dá)降低。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，敲除Slit2可增強ESCC細(xì)胞遷移，而Slit2穩(wěn)定的過表達(dá)則減弱了ESCC細(xì)胞遷移。Slit2/Robo1在胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Kim等[20]對11個胃癌細(xì)胞系、96對胃癌組織和相鄰正常胃組織中的Slit2表達(dá)和甲基化情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Slit2 在早期胃癌和晚期胃癌中均發(fā)現(xiàn)甲基化。Shi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中干擾Slit2表達(dá)會增加AKT磷酸化，從而活化抗凋亡信號，抑制GSK3β活性并誘導(dǎo)β-catenin活化入核，最后激活A(yù)KT/β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的腫瘤生長信號通路，促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移。Huang等[22]比較結(jié)直腸癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，CRC組織中Slit2基因的啟動子廣泛超甲基化從而導(dǎo)致Slit2表達(dá)減少，進(jìn)一步研究機制發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo、HCT116細(xì)胞中的泛素特異性蛋白酶33(USP33)與Robo1相互作用，增強細(xì)胞內(nèi)Slit2表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移 。Feng Y等[23]通過免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IFCRC)等研究方法發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中srGAP1是Robo1的相互作用蛋白, srGAP1是CRC中Slit2信號的重要下游分子，通過抑制Cdc42介導(dǎo)Slit2的抗遷移功能。但是，也有學(xué)者認(rèn)為, Slit2/Robo1促進(jìn)腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展。Qian等[24]研究發(fā)現(xiàn), Slit2/Robo1結(jié)合可以通過激活Src磷酸化，進(jìn)而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(β-catenin)通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(EMT)繼而促進(jìn)腸道腫瘤發(fā)生。最新的研究[25]顯示, Slit2還可能是遺傳性結(jié)直腸癌(CRC)遺傳易感性的潛在作用基因。

在消化系統(tǒng)腫瘤中，也已發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(micro-RNA)通過Slit2/Robo1信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。miR-1179在ESCC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過抑制Slit2/Robo1通路增強ESCC細(xì)胞的侵襲能力[26]; 在胃癌細(xì)胞中, miR-218的表達(dá)與Slit2的甲基化呈負(fù)相關(guān), miR-218通過作用于Robo1干擾Slit2/Robo1通路，從而破壞胃癌血管的行成，抑制腫瘤細(xì)胞生長[27]。

3.2 Slit2/Robo1與胰腺癌、肝癌

Katia等[10]從表觀遺傳學(xué)的角度研究了Slit2/Robo1在腺癌中的變化，在對167例胰腺導(dǎo)管腺癌組織行大規(guī)模的甲基化和表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn), Slit2與Robo1的CpG島和啟動子區(qū)域均出現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致Slit2-Robo1信號通路的表觀遺傳失活。JIANG等[28]建立了胰腺癌細(xì)胞系和高淋巴轉(zhuǎn)移潛能的小鼠模型，并觀察到胰腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移型小鼠中Robo1較未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠表達(dá)下調(diào)。值得注意的是, Secq等[29]研究了腫瘤內(nèi)微環(huán)境(基質(zhì))對PDAC進(jìn)展的影響，發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)分泌Slit2通過調(diào)節(jié)N-鈣黏蛋白/β-catenin信號傳導(dǎo)，促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元以及施旺(Schwann) 細(xì)胞遷移與增殖，從而增加神經(jīng)突的生長，抑制Slit2/Robo1信號傳導(dǎo)則可破壞這種基質(zhì)、神經(jīng)連接，減少患者術(shù)后復(fù)發(fā)率和腫瘤后期疼痛感。Jin[30]等首先報道了肝癌細(xì)胞中(HCC)中存在Slit2的表觀遺傳學(xué)沉默，他們通過對54例原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行甲基化分析發(fā)現(xiàn)，由于Slit2的CpG島高甲基化，使其表達(dá)較正常肝細(xì)胞下調(diào)。Mano等[31]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，抑制Slit2/Robo1表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移，而過度表達(dá)Robo1與Slit2則可以顯著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移。Slit2/Robo1為肝癌的治療提供一個新的可能治療靶點。

4 Slit2/Robo1與婦科腫瘤

4.1 Slit2/Robo1與卵巢癌

RDONG等[32]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織和卵巢癌患者血清樣品中Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化狀態(tài)，其中包括早期卵巢癌患者的血清樣品。Hai等[33]也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象，在將Slit2去甲基化恢復(fù)表達(dá)后，可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞生長、遷移、集落形成能力并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 這些結(jié)果表明Slit2是卵巢癌的腫瘤抑制因子，將來可能是卵巢癌治療的新靶點。

4.2 Slit2/Robo1與子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌

子宮內(nèi)膜癌(EC)是常見的女性惡性疾病，約占女性腫瘤的7%, 是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占生殖道惡性腫瘤的20%～30%[34]。目前的研究主要認(rèn)為, Slit2/Robo1信號通路通過調(diào)控內(nèi)膜癌組織中的微血管密度而影響子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后及復(fù)發(fā)。Shulan等[35]對比了45例子宮內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)患者與110例未復(fù)發(fā)患者的Slit2與Robo1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Slit2和Robo1在復(fù)發(fā)組內(nèi)膜癌中表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)組，且Slit2和Robo1 表達(dá)均與微血管密度(MVD)呈正相關(guān)。有趣的是，目前有學(xué)者[36]發(fā)現(xiàn)，一定濃度雌激素可以刺激子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的Slit2 mRNA的表達(dá)，而孕激素則會拮抗上述作用。Ratnesh KS等[37]通過微衛(wèi)星分析發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織樣本中Slit2啟動子超甲基化及Slit2缺失現(xiàn)象，經(jīng)多因素分析顯示Slit2缺失與其啟動子甲基化存在顯著相關(guān)性，可能在宮頸癌發(fā)展中起重要作用。Sraboni M等[38]通過對宮頸癌組織樣本和宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性宮頸癌中Slit2和Robo1的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均降低，認(rèn)為Slit2/Robo1的表達(dá)水平與腫瘤的分期和預(yù)后有關(guān), Slit2/Robo1表達(dá)越低則預(yù)示著腫瘤分期越高、預(yù)后越差。

5 Slit2/Robo1與其他腫瘤

5.1 Slit2/Robo1與乳腺癌

Slit2/Robo1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Dallol等[39]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織中的Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化，從而下調(diào)了Slit2的表達(dá)。Feng等[40]通過評估118例浸潤性導(dǎo)管癌(IDC), 44例導(dǎo)管原位癌(DCIS)和34例良性乳腺病變的Slit2和Robo1的免疫組織化學(xué)染色、mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn), Slit2和Robo1低表達(dá)的浸潤性導(dǎo)管癌患者預(yù)后較差，且較大概率出現(xiàn)腦特異性轉(zhuǎn)移。Chang等[41]對乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞的致癌潛力是由其Robo1受體及其間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌的配體Slit2之間的相互作用決定的?；钚許lit2/Robo1信號的存在能阻止β-catenin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，繼而通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑下調(diào)c-myc和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。結(jié)合臨床，乳腺癌細(xì)胞中的Robo1表達(dá)與乳腺癌患者生存期呈正相關(guān)，基質(zhì)成纖維細(xì)胞中Slit2的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。根據(jù)目前研究提示Slit2/Robo1可能在抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展及腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。可能成為判斷乳腺癌預(yù)后和腦轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，為乳腺癌的治療提供新靶點。

5.2 Slit2/Robo1與肺癌

Slit2/Robo1在肺癌中的作用較為復(fù)雜。Yong-Jae等[42]對人肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)組織與正常肺組織進(jìn)行焦磷酸測序法分析發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Slit2啟動子區(qū)域的出現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象。Suzuki等[43]在非小細(xì)胞肺癌組織中也檢測到類似現(xiàn)象。Li等[44]對非小細(xì)胞肺癌癌旁組織、肺癌組織、腦轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行Robo1表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Robo1的陽性表達(dá)率依次增高，且 Robo1在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的表達(dá)與肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Wen等[45]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了泛素特異性蛋白酶33(USP33)可以調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的Slit-Robo信號傳導(dǎo)，在正常肺細(xì)胞中, Slit2結(jié)合Robo1并激活下游分子，調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架并抑制細(xì)胞遷移。 去泛素化酶USP33可減少Robo1的泛素化和降解，從而穩(wěn)定Robo1蛋白。 然而，在肺癌細(xì)胞中，表達(dá)下調(diào)的USP33導(dǎo)致Robo1的泛素化和降解增加，從而干擾了Slit2/Robo1信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移。

6 小 結(jié)

Slit2/Robo1在不同腫瘤中機制不同，作用也不盡相同。Slit2/Robo1除了通過抑制或促進(jìn)Wnt/β-catenin等經(jīng)典的原癌通路來促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也可以通過影響腫瘤血管密度、腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移。值得注意的是，在結(jié)直腸癌中，不同的學(xué)者發(fā)現(xiàn)了Slit2/Robo1兩種相反的作用，這可能與Robo1的突變有關(guān)。Feng等[46]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，在白血病細(xì)胞中過表達(dá)Robo1可以產(chǎn)生抗增殖和促凋亡作用，然而，這種作用在Robo1突變體中喪失。Robo1在結(jié)直腸癌或其他腫瘤中是否存在突變并引起相反的兩種作用值得進(jìn)一步研究。近年來，隨著對microRNA的認(rèn)識及研究深入，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過作用于Slit2或Robo1從而影響腫瘤的進(jìn)展。其中miR-218在膠質(zhì)瘤、胃癌等多種腫瘤中均可以作用于Slit2/Robo1起到抑癌作用，這也為腫瘤的靶向治療提供新的思路。因此, Slit2/Robo1信號通路有可能成為多種腫瘤預(yù)防和治療的潛在靶標(biāo)。