王媛媛 曹建 鄧莉

[摘要] 目的 研究Toll樣受體3（TLR3）在大鼠心肌梗死中的表達及作用機制。 方法 制備TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠，采用球囊結(jié)扎冠脈方法制作心肌梗死動物模型。隨機分為野生型假手術(shù)組（n=15）、野生型心肌梗死組（n=15）、（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15）、（TLR3-/-）心肌梗死組（n=15）。檢測心肌組織肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI含量；通過Western blot法檢測Toll樣受體3、NF-κB表達。 結(jié)果 與野生型心肌梗死組大鼠比較，（TLR3-/-）心肌梗死組反映心肌損傷的CK-MB、cTnI減低；NF-κB表達降低；各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 TLR3基因缺失在急性心肌梗死中具有心臟保護作用，其保護機制與下調(diào)NF-κB表達，減輕心肌梗死炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] TOLL樣受體3；急性心肌梗死；核因子-κB；基因敲除

[中圖分類號] R541；R392 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）01-0036-03

Mechanism of Toll-like receptor 3 in acute myocardial infarction in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 DENG Li1

1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang， Nanchang 330009，China； 2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang， 330006，China

[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 3（TLR3） in myocardial infarction of rats and its mechanism. Methods TLR3 gene knockout rats and wild-type rats were prepared. Animal models of myocardial infarction were created by balloon ligation of coronary arteries. The rats were randomly divided into wild-type sham surgery group （n=15）， wild-type myocardial infarction group（n=15），（TLR3-/-）sham surgery group（n=15）， and（TLR3-/-）myocardial infarction group（n=15）. The creatine kinase（CK-MB）and troponin cTnI contents in myocardial tissues were measured. Toll-like receptor 3 and NF-κB expressions were detected by Western blot method. Results Compared with the rats in the wild-type myocardial infarction group， the levels of CK-MB and cTnI which reflected myocardial injury in the（TLR3-/-） myocardial infarction group were decreased； NF-κB expression was decreased； the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion TLR3 gene deletion has cardioprotective effects in acute myocardial infarction. Its protective mechanism is related to the down-regulation of NF-κB expression and alleviation of inflammatory response induced by myocardial infarction.

[Key words] TOLL-like receptor 3； Acute myocardial infarction； NF-κB； Gene knockout

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，研究表明，在心肌梗死后，心肌組織會分泌大量炎性因子（如白細胞介素），炎癥因子局部異常表達及不適當(dāng)堆積可激活細胞毒性 T 細胞造成心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙，與心室重塑密切相關(guān)[1-3]。此外還可引起心肌細胞凋亡，在調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。調(diào)節(jié)炎性細胞因子網(wǎng)絡(luò)是心肌梗死后重要治療方法之一。

Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）是生物體重要的病原體模式識別信號分子，不同的TLRs識別不同的病毒、細菌、真菌或原生物。TLRs通過促使炎性因子和干擾素釋放來抵抗病原微生物感染其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，目前TLR3在急性心肌梗死中的作用機制尚未闡明，本實驗通過制備TLR3基因敲除大鼠，并制備急性心肌梗死模型，來觀察TLR3基因敲除后對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑材料

本研究已經(jīng)通過南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查，許可證號為SCXM（贛）2014-0012，TLR3基因敲除大鼠，8周齡，雌雄各半（由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供）。野生型SD大鼠（南昌大學(xué)實驗動物中心提供）。兔抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國Sigma公司）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白cTnI檢測試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司）、小鼠抗Akt單克隆抗體、TLR3抗體、NF-κB抗體購自美國Santa Cruz公司，蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)品購自普利萊公司。

1.2 建立動物模型

實驗動物分為四組，制作大鼠急性心肌梗死模型，雄性SD大鼠，術(shù)前4 h禁食水，SD大鼠稱重后以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，連接小動物呼吸機，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部2～3 mm處，結(jié)扎左前降支深部，心電圖可見相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)sT段抬高，同時肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域心肌變白，局部心肌運動減弱提示結(jié)扎成功。假手術(shù)組僅分離左前降支，不結(jié)扎[4]。野生型假手術(shù)組（n=15），絲線穿過冠狀動脈但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；野生型急性心肌梗死（AMI）對照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型；（TLR3-/-）假手術(shù)組（n=15），絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；（TLR3-/-）急性心肌梗死對照組（n=15）制作大鼠急性心肌梗死模型。

檢測生化指標(biāo)急性心肌梗死模型制作2 h后，從腹主動脈采血5 mL，靜置30 min，按照試劑盒說明操作，離心10 min（4℃，3000 r/min），進行血清分離，測定血清CK-MB及cTnI的含量，cTnI檢測采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，CK-MB檢測采用酶聯(lián)免疫發(fā)光法。

1.3 Western blot法檢測TLR3、NF-κB蛋白表達

制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，提取按試劑盒說明書步驟提取總蛋白，碾磨心肌組織，BCA法蛋白進行蛋白定量，SDS-PAGE分離樣品后轉(zhuǎn)膜，常溫下TBST封閉過夜，加入一抗后室溫下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗2 h，顯影，定影，掃描。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組cTnI、CK-MB水平比較

與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/-）組反映心肌缺血損傷的cTnI、CK-MB含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、2。

2.2各組心肌組織TLR3、NF-κB蛋白表達

通過Western blot 法檢測各組TLR3、NF-κB蛋白水平。與野生型假手術(shù)組比較，野生型AMI組TLR3、NF-κB蛋白表達均增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與野生型AMI組比較，（TLR3-/-）AMI組TLR3蛋白、NF-κB蛋白表達均降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、3。

3 討論

急性心肌梗死致死致殘率高，是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，缺血心肌細胞線粒體功能障礙導(dǎo)致需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，線粒體內(nèi)膜通透性改變，介導(dǎo)的心肌細胞凋亡、從而存活心肌細胞減少，從而導(dǎo)致急性心肌梗死患者梗死后心衰[5-9]。

Toll樣受體是內(nèi)源性免疫的一個重要分子家族，分為細胞外區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)，內(nèi)區(qū)與白細胞介素-1受體結(jié)構(gòu)相似的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成，能識別侵入體內(nèi)異物，不僅激活固有免疫應(yīng)答，還可以激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，啟動下游的信號通路，通過募集中性粒細胞、吞噬細胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子（如各種白介素因子）介導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，不同的病原體入侵可激活相應(yīng)的TLR，從而誘發(fā)初始免疫反應(yīng)產(chǎn)生炎癥。TLR3由904個氨基酸組成，其相對分子量約為125 ku，研究發(fā)現(xiàn)TLR3可誘導(dǎo)血管活性氧產(chǎn)生增加，可引起血管舒張功能受損、再內(nèi)皮化減少加劇內(nèi)皮細胞功能受損[10-14]。同時TLR3還可以識別病毒、細菌和受感染細胞中的核酸成分，誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細胞因子，人類TLR3在人動脈粥樣硬化組織起源的平滑肌細胞上的表達上調(diào)，可引起許多趨化因子和炎性細胞因子表達增加[15-17]。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為可誘導(dǎo)并普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可對相當(dāng)多數(shù)量的基因發(fā)揮中心性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在免疫、炎癥、細胞的生存、增殖分化和凋亡等方面起到廣泛而重要作用。通過對腫瘤壞死因子、細胞介素（IL-1，IL-，6，IL-8）等基因的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)增加炎癥反應(yīng)[18-21]。

本實驗通過TLR3基因敲除大鼠及野生型大鼠制作急性心肌梗死模型。野生型實驗組經(jīng)過急性心肌梗死處理，與假手術(shù)組比較，cTnI、CK-MB含量增加，TLR3蛋白及NF-κB表達增加。與野生型急性心肌梗死組比較，（TLR3-/- ）急性心肌梗死組cTnI、CK-MB含量減少。TLR3蛋白減低，NF-κB表達降低。本實驗結(jié)果提示急性心肌梗死可以刺激TLR3表達，進一步激活NF-κB，引起心肌炎癥反應(yīng)，引起心肌損傷；而在TLR3基因敲除組大鼠，TLR3蛋白表達下降，急性心肌缺血損傷后，NF-κB表達下降，cTnI、CK-MB較野生型含量減少，提示TLR3基因缺失可通過減少NF-κB表達減輕炎癥反應(yīng)，對急性梗死心肌起到保護作用。提示 TLR3在急性心肌梗死的發(fā)展過程中起著保護作用，但其確切的機制尚未完全明確，需要進一步明確，為治療急性心肌梗死提供新的治療靶點。

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（收稿日期：2017-09-25）