閆紫薇，趙云，張瑞濤

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443000；2三峽大學(xué)第一人民醫(yī)院)

血腦屏障是由各種緊密連接蛋白連接的內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞的足突、周細胞及基底膜等構(gòu)成，是神經(jīng)血管單位的選擇性屏障。血腦屏障僅允許小分子的親脂性藥物通過，阻止幾乎所有大分子和99%的目前可用的小分子(>400 Da)藥物進入大腦[1，2]，因此限制了藥物對腦惡性腫瘤的治療?？朔X屏障的辦法包括：打開顱骨直接將藥物注射到靶區(qū)；通過鞘內(nèi)注射藥物到腦脊液，然后擴散到腦實質(zhì)；改變藥物結(jié)構(gòu)使其能夠被動擴散通過血腦屏障；通過化學(xué)方法開放血腦屏障等。但侵入性操作存在出血、感染的風險，化學(xué)方法靶向性較差或費用昂貴。微泡是一種聲學(xué)造影劑，低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡已經(jīng)被證實能夠可逆性開放血腦屏障，有助于藥物透過血腦屏障進入腦實質(zhì)，同時微泡還可以作為藥物載體聯(lián)合低頻聚焦超聲靶向遞送藥物至腦內(nèi)。本文主要闡述超聲微泡開放血腦屏障的機制，闡述其介導(dǎo)藥物治療腦惡性腫瘤的作用及局限性。

1 超聲微泡開放血腦屏障的機制

1.1 機械效應(yīng) 低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠無創(chuàng)性、靶向性、可逆性開放血腦屏障，有利于促進藥物在腦內(nèi)釋放。如果超聲照射的聲壓比較低，微泡就會發(fā)生穩(wěn)定空化。穩(wěn)定空化產(chǎn)生的剪切應(yīng)力和微流(微泡振蕩產(chǎn)生微泡周圍的流體流，即源于微泡的放射力)，造成局部沖擊波。這些機械效應(yīng)導(dǎo)致血腦屏障緊密連接的完整性下降[3，4]，內(nèi)皮細胞腔面細胞膜變形或通透性增加[4]。超聲輻照使微泡在毛細血管中快速膨脹和收縮，較大的微泡膨脹時導(dǎo)致血管壁機械拉伸，從而打開內(nèi)皮細胞的緊密連接，導(dǎo)致血腦屏障的功能破壞。鄧金木等[5]研究表明，聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的程度要大于聚焦超聲和微泡單獨使用之和。

1.2 應(yīng)激反應(yīng) 低頻超聲穿透性強，可在不打開顱骨的情況下促使血腦屏障開放。當對生物組織進行超聲照射時，可以誘導(dǎo)進入組織的微泡產(chǎn)生非線性振蕩。微泡非線性振蕩也可能減少局部血流量，使局部暫時性缺血，導(dǎo)致缺氧性應(yīng)激反應(yīng)，從而破壞并開放血腦屏障[6]。

1.3 促進內(nèi)吞 超聲微泡的穩(wěn)態(tài)空化會對血管壁產(chǎn)生機械應(yīng)力和剪切應(yīng)力，影響內(nèi)皮細胞中的機械敏感蛋白，將細胞外的機械信號轉(zhuǎn)化成細胞內(nèi)的生物化學(xué)信號[7]。caveolae是位于細胞質(zhì)膜表面的囊狀結(jié)構(gòu)，其主要功能是介導(dǎo)跨細胞膜的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運，其中最重要的標志性蛋白分子是caveolin-1，血腦屏障的開放程度與caveolin-1的表達水平一致。研究表明，聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠有效增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管內(nèi)皮細胞上caveolae的數(shù)量及caveolin-1蛋白表達水平，提示聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障時，caveolae介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)揮了非常重要的作用[5]。

1.4 抑制外排 血腦屏障既是物理屏障又是功能屏障。聚焦超聲聯(lián)合微泡可以影響緊密連接，限制被動的細胞旁途徑以及刺激囊泡跨細胞轉(zhuǎn)運[8]，具有暫時破壞血腦屏障的能力。P-糖蛋白是在血腦屏障內(nèi)皮細胞膜上表達的最主要的多藥耐藥蛋白，其底物包括多柔比星(DOX)、柔紅霉素、長春堿、長春新堿、依托泊苷等抗癌藥物。P-糖蛋白可主動泵出大部分藥物，減少藥物在腦組織中的滯留和累積。此外，P-糖蛋白在腫瘤中的存在有助于癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性并降低療效。研究發(fā)現(xiàn)，超聲可以暫時抑制P-糖蛋白的表達。當聲壓幅度為0.55 MPa時，血腦屏障被破壞，P-糖蛋白被抑制達48 h，恢復(fù)時間為72 h；當聲壓幅度為0.81 MPa時，抑制效應(yīng)可以持續(xù)72 h或更長。這些發(fā)現(xiàn)支持微泡聯(lián)合聚焦超聲通過抑制藥物外排破壞血腦屏障功能，導(dǎo)致藥物存在于腦實質(zhì)中的時間增加，從而增加藥物的功效[9]。

1.5 影響轉(zhuǎn)運途經(jīng) 研究表明，血腦屏障通透性增大的基礎(chǔ)是caveolae介導(dǎo)的claudin-5表達水平的改變[10]。claudin-5在大腦所有血管內(nèi)皮細胞上均有較高的表達，是緊密連接的關(guān)鍵性蛋白。聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障時，claudin-5表達水平顯著下降，即緊密連接復(fù)合體減少，說明claudin-5介導(dǎo)的細胞旁途徑在聚焦超聲聯(lián)合微泡打開血腦屏障中具有重要作用[5]。另有研究表明，claudin-5表達的變化要晚于caveolin-1，提示后者在血腦屏障開放早期具有重要意義[11]。由此可見，聚焦超聲聯(lián)合微泡所產(chǎn)生的機械力可能影響跨細胞途徑和細胞旁途徑，從而導(dǎo)致血腦屏障開放。

2 超聲微泡的載藥機制

2.1 作為載體傳送藥物 利用超聲微泡包裹藥物，可以作為有效載體，攜帶治療藥物轉(zhuǎn)移運到靶位點或目標組織，在轉(zhuǎn)運過程中微泡可以保護藥物有效載荷不被酶破壞，從而實現(xiàn)高精度的遞送治療藥物[12]。超聲微泡攜帶藥物或基因的方式有很多種，如：將基因或藥物直接黏附于微泡殼膜表面，使用帶正電荷脂質(zhì)層殼微泡，靜電結(jié)合帶負電荷的核酸，例如siRNA、miRNA、mRNA和質(zhì)粒DNA；將基因或藥物包裹入微泡內(nèi)部，疏水性藥物可以封裝在穩(wěn)定微泡的脂質(zhì)或聚合物殼內(nèi)；將基因或藥物包裹在雙分子層微泡內(nèi)外層之間。超聲脈沖引起的極端振蕩導(dǎo)致微泡破裂，藥物被釋放。

2.2 增加藥物吸收 微泡在腫瘤微血管中震蕩可以增加內(nèi)皮細胞的通透性，增強藥物外滲，增加細胞對藥物的吸收，從而導(dǎo)致腫瘤血管破壞及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少[12]。穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)空化現(xiàn)象在增加生物屏障(包括血管內(nèi)皮和細胞質(zhì)膜)的瞬時通透性中都會發(fā)揮作用。通過影響跨細胞途經(jīng)、細胞旁路途經(jīng)及增加細胞膜孔隙的方式導(dǎo)致生物屏障的通透性增加，有利于細胞攝取及外滲治療性藥物分子[13～15]。這些載有藥物或基因的微泡在體內(nèi)的循環(huán)可以使用超聲對比成像進行追蹤，隨后使用超聲脈沖破壞微泡，使有效載荷在靶組織或靶器官釋放[16]。

3 超聲微泡開放血腦屏障在治療腦惡性腫瘤中的應(yīng)用

3.1 超聲微泡在化療藥物治療腦惡性腫瘤中的作用 卡莫司汀是治療腦膠質(zhì)瘤的常用化療藥物。載有卡莫司汀的脂質(zhì)微泡聯(lián)合聚焦超聲實現(xiàn)了卡莫司汀在腦內(nèi)靶向釋放，卡莫司汀微泡使卡莫司汀的半衰期延長5倍，并且增強了藥物向大腦的遞送效率。研究表明，卡莫司汀微泡與單獨使用卡莫司汀的對照組相比對，肝臟的毒性更小，對腫瘤的治療效果更好，實驗動物的中位生存時間及最大存活時間顯著延長。

血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGF-R2)在膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細胞中過度表達，其主要功能是介導(dǎo)細胞增殖和遷移，并導(dǎo)致腫瘤區(qū)域的血管過度生成。研究者設(shè)計了一種結(jié)合VEGF-R2-配體和卡莫司汀的微泡，命名為VEGF-BCNU-MBs，靶向遞送藥物至過度表達VEGF-R2受體的腫瘤血管系統(tǒng)，免疫熒光染色證實腫瘤區(qū)域藥物濃度的累積增高。VEGF-BCNU-MBs與載卡莫司汀微泡相比，肝臟毒性更小，對腫瘤的抑制作用更強[17]。

紫杉醇是一種廣泛應(yīng)用于顱外癌癥的抗腫瘤藥物，脂質(zhì)體能夠包封疏水性紫杉醇，從而減少藥物的毒性，同時增強其治療效果，紫杉醇脂質(zhì)體(PTX-LIPO)是一種有前途的抗腫瘤制劑，但血腦屏障及血液腫瘤屏障(BTB)的存在使得脂質(zhì)體藥物難以穿過，導(dǎo)致其在腦惡性腫瘤的應(yīng)用受到限制。Shen等[18]研究表明，聚焦超聲聯(lián)合微泡可以提高PTX-LIPO穿透血腦屏障及血液腫瘤屏障的遞送效率。與未經(jīng)聚焦超聲治療組相比，超聲微泡組中膠質(zhì)母細胞瘤中累積的藥物濃度增加了2倍，且腫瘤裸鼠的中等存活時間延長了20.8%。

DOX廣泛用于顱外腫瘤的治療，但對顱內(nèi)惡性腫瘤無效，其原因也是由于DOX的脂質(zhì)體不易穿越完整的血腦屏障。Treat等[19]研究表明，聚焦超聲聯(lián)合微泡破壞了完整的血腦屏障，可以顯著增加DOX脂質(zhì)體治療腦惡性腫瘤效果。

目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(白血病細胞浸潤腦膜或腦實質(zhì))常用的治療方法有放療、全身化療以及鞘內(nèi)注藥化療，存在腦組織損傷、出血、感染、腦脊液漏、血栓等風險。阿糖胞苷是治療急性白血病的常用化療藥物，利用低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠顯著增加腦組織阿糖胞苷濃度[20]，避免大劑量靜脈給藥可能帶來的全身不良反應(yīng)。

3.2 超聲微泡在生物免疫治療腦惡性腫瘤中的應(yīng)用 HER2靶向抗體(即曲妥珠單抗和培妥珠單抗)可以延長顱外轉(zhuǎn)移HER2陽性乳腺癌患者的存活率，但是腦轉(zhuǎn)移瘤對這些藥物的反應(yīng)很差。Kobus等[21]研究表明，使用超聲微泡聯(lián)合HER2靶向抗體可以抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的生長，而且他們的研究還發(fā)現(xiàn)，對HER2單抗不敏感的腦惡性腫瘤患者也可能受益于聚焦超聲介導(dǎo)的血腦屏障破壞。

使用低密度脂蛋白(LDL)納米顆粒結(jié)合超聲微泡開放血腦屏障運送二十二碳六烯酸(DHA)到大腦，可以用于急性腦損傷的區(qū)域治療或靶向遞送藥物治療腦惡性腫瘤。使用超聲微泡聯(lián)合LDL-DHA納米顆粒，DHA不僅進入大腦，而且能攝入腦細胞，使腦內(nèi)的DHA水平增加2倍。

抗腫瘤自殺基因療法是將無毒前藥轉(zhuǎn)化為細胞毒性藥物的基因?qū)肽[瘤細胞，而達到抑制或殺傷腫瘤組織的目的，是治療腦惡性腫瘤的一種新療法。將單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)基因轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞中，可增強細胞對抗病毒藥物的敏感性。HSV1-tk可以將更昔洛韋(GCV)磷酸化為單磷酸，然后通過細胞激酶磷轉(zhuǎn)化為二磷酸鹽和三磷酸鹽，GCV的二磷酸鹽和三磷酸鹽對處于增殖期的哺乳動物細胞有很強的毒性作用，從而殺傷處于活躍增殖狀態(tài)的腫瘤細胞。Yang等[22]報道，超聲微泡聯(lián)合GCV與單獨GCV治療相比，能更顯著地抑制帶有熒光素酶/綠色熒光蛋白/HSV1-tk三重報道基因的原位F98神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。Yang等[23]研究顯示，聚焦超聲誘導(dǎo)的血腦屏障破壞能夠?qū)⒏邉┝康幕熕幬锛械侥X惡性腫瘤中，并增強其抗腫瘤作用。

白細胞介素12(IL-12)不僅是免疫系統(tǒng)的重要成分，還是一種潛在的強效抗腫瘤細胞因子。Pin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IL-12腹腔給藥聯(lián)合超聲微泡打開血腦屏障組同對照組相比，其腦惡性腫瘤中的IL-12增加更顯著，CTL增加和CTL/Treg比例增加，更有助于抑制腫瘤發(fā)展及延長動物的存活時間。說明聚焦超聲開放血腦屏障可以增強免疫調(diào)節(jié)劑遞送至大腦，提高了腦惡性腫瘤治療中的抗癌免疫應(yīng)答。

3.3 超聲微泡在放療治療腦惡性腫瘤中的作用 硼中子俘獲治療是臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物靶向放射治療方法，該療法是將含硼的藥物施用于癌細胞然后用熱中子照射，使硼原子與熱中子發(fā)生俘獲反應(yīng)，產(chǎn)生的射線會破壞癌細胞的遺傳物質(zhì)并使其死亡。超聲聯(lián)合微泡打開血腦屏障的方式使硼苯丙氨酸的腦內(nèi)吸收增加，提高了硼中子俘獲治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效果。

4 超聲微泡應(yīng)用的局限性

4.1 超聲微泡可能造成腦損傷 超聲與微泡相互作用時不僅釋放藥物，還可能誘導(dǎo)血腦屏障的組織學(xué)損傷。低強度聚焦超聲聯(lián)合微泡打開血腦屏障時，機械聲學(xué)空化效應(yīng)會導(dǎo)致熱休克蛋白、IL-1、IL-18、TNF-α升高，提示可能存在無菌性炎癥反應(yīng)。但也有研究提出了相反觀點，認為聚焦超聲聯(lián)合微泡可以安全可控地對恒河猴進行腦內(nèi)靶向給藥，在0.20～0.30 MPa的聲壓強度下，可以破壞血腦屏障并且沒有腦組織損傷，沒有行為改變及視力損傷，由此說明特定參數(shù)的聚焦超聲聯(lián)合微泡對于非人類靈長類動物是安全的[25,26]。

有人提出，在聚焦超聲誘導(dǎo)的血腦屏障破壞模型中，可通過低強度脈沖超聲來減小腦損傷，有效調(diào)節(jié)聚焦超聲誘導(dǎo)的血腦屏障破壞的通透性和時間窗口，使藥物可以精準控釋到大腦中。在聚焦超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)血腦屏障破壞中，Su等[27]最先研究了使用低強度脈沖超聲來調(diào)節(jié)血腦屏障持續(xù)時間并減少腦水腫，結(jié)果表明低強度脈沖超聲治療能有效減輕大鼠腦損傷、神經(jīng)元損傷和細胞凋亡。因此，選擇合適的治療參數(shù)能有效保障治療的安全性。

4.2 超聲微泡可能導(dǎo)致的其他并發(fā)癥 Aryal等[28]在使用DOX脂質(zhì)體聯(lián)合超聲微泡治療膠質(zhì)瘤大鼠時發(fā)生的一些不良反應(yīng)，包括廣泛的瘤內(nèi)出血、腫瘤周圍腦組織損傷、腫瘤位點組織缺失、活動受限、皮膚毒性等。瘤內(nèi)出血可能與腫瘤的血管壁壞死有關(guān)，皮膚毒性可能與DOX已知的不良反應(yīng)有關(guān)。由于目前的研究樣本量有限，未來還需要研究者做更多的工作來研究相關(guān)治療的有效性的不良反應(yīng)的發(fā)生率。

5 小結(jié)與展望

血腦屏障限制了腦惡性腫瘤的藥物治療，隨著分子影像技術(shù)學(xué)的發(fā)展，超聲微泡為腦惡性腫瘤的治療帶來了新的希望。超聲微泡利用空化效應(yīng)能可逆性地開放血腦屏障，促進藥物進入腦內(nèi)，且微泡還能作為藥物載體，保護藥物在轉(zhuǎn)運途中不被酶破壞。研究者將超聲微泡與化療藥物、生物免疫治療、放療等相結(jié)合，提供了新的治療方法。但現(xiàn)在的研究大多數(shù)還停留在臨床前的研究，要將其應(yīng)用于臨床還需要解決一些問題：首先，超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的安全參數(shù)需要進一步明確，需要更多的試驗來提高其安全性；其次，超聲微泡用于開放血腦屏障治療腦惡性腫瘤的相關(guān)并發(fā)癥及不良反應(yīng)還需要進一步明確，并提出解決的方法。