周游，季菊玲

(1南通大學醫(yī)學院，江蘇南通226001；2海門市人民醫(yī)院)

肝細胞癌(HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤。HCC常發(fā)生于炎癥和慢性損傷的肝臟，不易早期發(fā)現(xiàn)。超聲檢查易受操作者經(jīng)驗的影響，CT和MRI檢查也僅在結節(jié)直徑大于1 cm時有效，且難以鑒別早期HCC和肝硬化不典型增生結節(jié)。結節(jié)較小時，腫瘤活檢的難度增加，對組織學診斷也是一大挑戰(zhàn)。通過外周血檢測HCC具有操作簡便、非侵入性和可重復性等優(yōu)點。近年來采用基因組學、蛋白質組學等新技術手段對HCC原發(fā)腫瘤、循環(huán)非編碼核酸、循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA等開展了大量研究，拓展了通過外周血檢測HCC的方法和途徑?，F(xiàn)將該領域的研究進展綜述如下。

1 血清蛋白標志物

1.1 甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白異質體3(AFP-L3) AFP是目前臨床應用最廣泛的HCC標志物。AFP臨床檢測多用化學發(fā)光法，主要用于HCC高危人群的篩查和診斷、HCC進展監(jiān)測及預后判斷、對治療反應的觀察。AFP基因在胎兒期于卵黃囊肝細胞和內(nèi)胚層細胞中表達，出生后表達下降。AFP的主要功能是在胎兒期調控脂肪酸代謝和成年后促進肝細胞增生。由于細胞增生和再生加速，活動性肝炎患者可出現(xiàn)血清AFP水平升高。正常AFP水平上限為20 ng/mL，慢性肝炎患者可輕微超過20 ng/mL，但不能診斷為HCC，采用20 ng/mL作為臨界值將導致特異性降低。臨床上AFP水平超過400 ng/mL時能明確診斷HCC，但這個值缺乏靈敏度。近年研究發(fā)現(xiàn)，AFP聯(lián)合Gd-EOB-DTPA增強MRI(EOB-MRI)可以用來判斷HCC患者預后。正釓塞酸二鈉(Gd-EOB-DTPA)攝取與血清AFP低水平和HCC患者預后良好有關，而血清AFP水平升高、Gd-EOB-DTPA攝取降低的HCC患者與致癌基因FOXM1的激活和預后不良相關[1]。

AFP-L3是AFP的異質體。AFP的異質性與糖鏈的巖藻糖基化有關，HCC細胞產(chǎn)生的AFP糖鏈和肝硬化患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AFP糖鏈對凝集素的親和力不同。AFP-L3由HCC細胞產(chǎn)生，對HCC的診斷更特異。因此AFP-L3可能是區(qū)分HCC和慢性肝病的有用標志物。小HCC(直徑<3 cm)患者中約35%能檢測到AFP-L3。高水平AFP-L3存在于體積大、多結節(jié)、低分化的晚期HCC，AFP-L3陽性提示HCC預后較差。

1.2 脫-γ-羧基凝血酶原(DCP) 維生素K是凝血因子γ-羧化酶的輔酶，維生素K缺乏導致肝臟凝血酶原合成異常，形成DCP，DCP可反映肝細胞功能異常[2]。癌變肝細胞中也可出現(xiàn)維生素K依賴性凝血因子羧化不足，從而生成大量DCP。以DCP 40 mAU/mL作為HCC診斷的臨界值，可提高小HCC的早期檢出率。然而DCP診斷的靈敏度和特異性受到腫瘤體積的影響，DCP診斷的準確性在長期阻塞性黃疸、肝內(nèi)膽汁淤積以及攝入華法林時下降。Toyoda等[3]研究發(fā)現(xiàn)，血清DCP水平與HCC進展、肝功能和肝纖維化程度密切相關，DCP有助于HCC的診斷和預后評估。

1.3 磷脂?；嫉鞍拙厶?3(GPC3) GPC3是一種癌胚抗原，其編碼一種硫酸類肝素蛋白多糖，通過糖基磷脂?；脊潭ㄔ诩毎砻妫c生長因子相互作用，并調節(jié)其功能。研究表明，GPC3在成人正常組織中不表達或低表達，在HCC高表達，是一個非常有潛力的HCC診斷標志物。40%～53%的HCC患者可檢測出GPC3，其中33%的HCC患者AFP和DCP均正常?？扇苄訥PC3在診斷高中分化HCC時的靈敏度高于AFP，可溶性GPC3與AFP聯(lián)用能將診斷靈敏度從50%提高到72%[4]。Feng等[5]研究發(fā)現(xiàn)，GPC3能預測腫瘤復發(fā)。GPC3通過刺激致癌信號傳導途徑促進HCC生長，在HCC中過表達，但在正常成人肝組織中不表達或低表達，因此是理想的HCC治療靶點。目前針對GPC3的HCC靶向治療抗體人MDX-1414、HN3和人源化小鼠GC33、YP7已處于臨床前評估或Ⅱ期臨床試驗階段。

1.4 骨橋蛋白(OPN) OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白。免疫細胞、上皮組織、平滑肌細胞、成骨細胞和腫瘤細胞均可產(chǎn)生OPN，正常肝臟組織表達很少，病理狀態(tài)下主要表達于活化的肝臟巨噬細胞和星狀細胞。有學者通過質譜分析血漿蛋白時發(fā)現(xiàn)，與肝硬化對照組相比，HCC患者中OPN顯著上調。Ye等[6]在原發(fā)和轉移性HCC的基因表達譜研究中發(fā)現(xiàn)，轉移性腫瘤中OPN中或高度上調。一項前瞻性研究提示，在HCC診斷確立前1年就可出現(xiàn)血清OPN升高。OPN在HCC診斷方面比AFP靈敏度更高，且可識別AFP陰性的HCC。另有研究顯示，人HCC組織中OPN與EGFR的表達呈正相關；敲減OPN可抑制EGFR介導的抗凋亡信號傳導，從而降低化學誘導HCC的發(fā)生率；認為OPN具有促進HCC發(fā)生的作用。

1.5 肝細胞生長因子(HGF) HGF是含728個氨基酸的肝素結合糖蛋白，是促進肝細胞再生的重要介質。在一項募集了99例患者的HCV相關肝臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶HCV的HCC患者血清HGF水平高于非攜帶者。在不考慮AFP或DCP水平的情況下，血清HGF高于0.6 ng/mL可診斷HCC。HCC通過旁分泌系統(tǒng)，包括細胞受體c-met參與HCC形成。c-met表達在侵襲性HCC中升高，與大體類型、血管侵犯、肝內(nèi)轉移和組織學類型有關，也與總體生存率降低有關。慢性肝病患者血清中也可檢測到HGF。肝硬化患者HGF血清水平增加是HCC形成的標志。HGF血清水平≥1.0 ng/mL與低生存率相關，術前高HGF水平與肝功能衰竭等術后并發(fā)癥的發(fā)生有關。術前血清HGF可評估肝功能并預測患者的預后，術后HGF血清水平升高能預示腫瘤的早期復發(fā)和轉移。

1.6 胰島素樣生長因子1(IGF-1) 血液中的IGF-1主要由肝細胞合成和分泌，是重要的促生長因子，可調控多種細胞從G1期進入S期，內(nèi)分泌和旁分泌產(chǎn)生的IGF-1在促進腫瘤生長過程中也起重要作用。Lippolis等[7]報道，IGF-1能拮抗瑞格菲尼對HCC細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用，以及藥物介導的凋亡，影響抗癌藥物的作用。Sprinzl等[8]報道，索拉非尼能調節(jié)巨噬細胞極化，在體外實驗中抑制IGF-1驅動的癌細胞生長，可能有助于索拉非尼的抗癌活性。

1.7 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) VEGF由血管內(nèi)皮細胞分泌，是一個關鍵的血管生成刺激因子。腫瘤組織中，瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞和肥大細胞也能分泌高水平的VEGF，多種癌癥中VEGF高表達與疾病進展和預后密切相關。研究表明，HCC患者VEGF的表達水平高于肝炎和肝硬化患者，可用于預測HCC轉移和復發(fā)、判斷HCC療效及預后。血液VEGF高表達與HCC肝內(nèi)轉移、微靜脈侵犯等顯著相關。Rohr-Udilova等[9]發(fā)現(xiàn)，VEGF有利于早期HCC的血管形成和生長，抑制酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼的治療和預防作用。針對VEGF受體的靶向治療藥物索拉菲尼也已應用于中晚期HCC。

1.8 鱗狀細胞癌抗原(SCCA)和鱗狀細胞癌抗原IgM免疫復合物(SCCA-IgM IC) SCCA屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑中的高分子量家族，對宮頸癌有較高的診斷價值，也用于肺鱗癌、食管鱗癌及其他鱗癌的輔助診斷和監(jiān)測，是最早用于鱗癌診斷的腫瘤標志物。正常肝臟組織中不表達SCCA，HCC組織中SCCA異常升高，可能因為肝細胞和鱗狀上皮細胞具有相同的胚胎來源。SCCA還具有保護腫瘤細胞免于凋亡、促進腫瘤生長的作用。SCCA異常表達是HCC形成中的一個早期事件，HCC患者血清SCCA水平高于肝硬化患者，在肝硬化發(fā)展為HCC的患者中能檢測到血清SCCA-IgM IC升高。SCCA-IgM IC血清水平與HCC患者肝切除標本中SCCA的表達呈正相關。

1.9 α-L-巖藻糖苷酶(AFU) AFU是一種溶酶體酶，與含巖藻糖的糖復合物降解有關。AFU活性在HCC患者高于健康人群、慢性肝病和肝硬化患者。血清AFU達到700 nmol/(mL·h)時，約82%的肝硬化患者會發(fā)展為HCC。在HCC患者中，AFU水平與腫瘤體積呈正相關，與AFP水平或丙氨酸轉氨酶活性無關。Wang等[10]實驗發(fā)現(xiàn)，術前AFU是總生存期(OS)的獨立預后因素，與AFU≤35 U/L的患者相比，術前AFU>35 U/L的患者無復發(fā)生存率和OS率較低，且較易形成大血管浸潤。AFU已廣泛應用于臨床，對AFP陰性病例及小HCC的診斷價值極大。

1.10 嗜鉻粒蛋白(CgA) CgA是一種存在于神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒中的酸性糖蛋白。HCC患者血清CgA水平升高，是早期發(fā)現(xiàn)HCC的有用指標，較高的CgA血清水平也提示患者預后較差。但CgA水平在HCC患者和肝硬化患者中都升高，診斷特異性低。此外，CgA水平可能與HCC的神經(jīng)內(nèi)分泌分化程度有關[11]。

2 血清非蛋白編碼核酸分子

2.1 微小RNA(miRNA) miRNA是高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，參與基因表達的轉錄后調控。約3%的人類基因組編碼miRNA序列，其廣泛參與機體的生理和病理過程[12]。定位于基因組脆弱位點的miRNA多與癌癥有關，具有調節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、轉移和侵襲的作用。由于正常肝細胞和HCC細胞以及不同HCC分型間miRNA的表達存在差異，這些差異的miRNA有可能成為HCC檢測和預后判斷的標志物[13]。

有學者報道，血清miR-122水平較高的HCC患者生存期更長，但血清miR-122水平不是影響患者生存的獨立因素。對正常肝臟、肝炎和HCC樣本的miRNA基因組進行比較，結果顯示HCC中miR-199a/b-3p下調，且與預后不良有關。miR-199a/b-3p參與調控PAK4/Raf/MEK/ERK通路，從而抑制HCC生長。通過腺病毒將miR-199a/b-3p擬似物遞送至小鼠HCC移植瘤，可抑制腫瘤生長，提示miR-199a/b-3p可作為HCC治療的潛在靶標。

Zhou等[14]通過檢測乙肝相關HCC患者外周血miRNA，發(fā)現(xiàn)7種miRNA(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a、miR-801)組合能顯著提高HCC的診斷準確性；不論疾病處于何種階段，都能保持穩(wěn)定的診斷準確率，且能區(qū)分HCC患者與健康人、慢性乙型肝炎患者與肝硬化患者，也可用于篩查AFP陰性的HCC患者。以上發(fā)現(xiàn)已于2018年轉化為HCC診斷試劑盒，即將投入臨床應用。

2.2 長鏈非編碼RNA(lncRNA) lncRNA是長度超過200 nt、保守性較低的內(nèi)源性RNA分子，能通過染色體修飾、轉錄和轉錄后加工等途徑調控基因表達。lncRNA具有信號、誘餌、指導、支架四種功能，參與基因表達和細胞周期的調控，與許多疾病相關。近年來，lncRNA在HCC中的作用也受到關注。長度大約為1.6 kb核苷酸的HULC在HCC中顯著上調，可通過細胞外信號調節(jié)激酶途徑促進YB-1的磷酸化，調節(jié)YB-1與某些致癌基因的相互作用，加速這些致癌基因mRNA在腫瘤發(fā)生過程中的翻譯[15]。Jiang等[16]發(fā)現(xiàn)，lnc-EGFR通過促進Treg細胞分化誘導免疫抑制，促進HCC。Yang等[17]報道了來自60個樣品的匹配陣列數(shù)據(jù)，顯示拷貝數(shù)變異和DNA甲基化的改變有助于觀察到235個lncRNA的反復失調，提供了與HCC腫瘤發(fā)生和轉移相關的功能性lncRNA和生物標志物的寶貴資源。

3 外周血腫瘤細胞及其產(chǎn)物

病理組織學檢查是腫瘤診斷的金標準。然而組織學活檢是侵入性的，而且單次活檢的信息有限，因此很難通過連續(xù)活檢監(jiān)測腫瘤進展。體液活檢是通過提取外周血中的腫瘤細胞或其產(chǎn)物，收集來自腫瘤的分子信息，樣本來源更容易，可以根據(jù)需要反復取樣，便于跟蹤隨訪。體液活檢目前主要包括循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA以及血清外泌體檢測。

3.1 循環(huán)腫瘤細胞(CTC) 大多數(shù)惡性腫瘤患者死于腫瘤細胞在遠隔器官的傳播和種植。傳統(tǒng)上認為轉移僅發(fā)生在病程晚期，實際上每克腫瘤組織每天約釋放100萬個細胞到血液中，僅有很少一部分能形成遠處轉移并繼續(xù)發(fā)展。最近基于乳腺癌實驗模型的研究發(fā)現(xiàn)，與單個CTC相比，CTC群的轉移潛能增加約50倍，與成熟癌細胞相比，CTC或許更能促進腫瘤進展[18]。

基于細胞體積、物理性質或特異細胞標志物捕獲CTC的技術也在不斷發(fā)展完善。FDA已批準第一個依賴一系列表面標記(CD45-、EpCAM+、CK8+、CK18+)捕捉和檢測CTC的方案。靶向EpCAM的抗體包被磁珠是目前使用最廣泛的CTC檢測技術。大多數(shù)HCC相關的研究采用基于EpCAM的方法來評估CTC，然而只有30%的HCC細胞表達EpCAM。在一項根據(jù)EpCAM mRNA+ CTC區(qū)分HCC患者和對照的研究中，EpCAM mRNA+ CTC的靈敏度為42.6%，特異性為96.7%；當EpCAM mRNA+ CTC和AFP聯(lián)合使用時，靈敏度提高至73.0%，特異性為93.4%。為實現(xiàn)異質性HCC CTC的有效分離、可靠檢測和亞型分析，Chen等[19]提出了基于抗CD45抗體修飾的磁性納米球的細胞分類方法，該方法能夠分離更多的異質性HCC細胞，并能分析同一個臨床HCC血液樣品的3種不同CTC亞型，有助于HCC的預后判斷或個性化治療。

CTC檢出率還受到腫瘤分期影響。一項研究評估了44例HCC患者的CTC，發(fā)現(xiàn)CTC或微栓子數(shù)量與腫瘤侵犯、門靜脈血栓及存活率顯著相關。對82例接受肝切除術HCC患者的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)CTC數(shù)量與肝內(nèi)、肝外復發(fā)有關，可獨立預測存活率。

3.2 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA) ctDNA可通過被動和主動的機制被釋放進入血液。對于正常組織，循環(huán)DNA可能主要通過細胞凋亡或壞死被動釋放。血漿DNA片段的不同長度能表明它們是來源于凋亡(較短，<150 bp)或是壞死細胞(較長，>150 bp)。健康個體的白細胞能清除凋亡和壞死細胞碎片，因此循環(huán)DNA保持在低水平。炎癥或惡性腫瘤時清除系統(tǒng)受損，血漿DNA水平增加。腫瘤細胞還有可能主動分泌釋放DNA片段，CTC也可成為ctDNA的來源。

ctDNA可用于拷貝數(shù)變異、甲基化改變、單核苷酸變異等特異性結構改變的分析。由于腫瘤存在異質性和亞克隆，檢測ctDNA與原發(fā)腫瘤所獲得的突變率也存在差異。一項納入106例結直腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，通過ctDNA檢測BRAF突變的靈敏度和特異度高達100%，檢測KRAS突變的靈敏度和特異度分別為92%和98%[20]。學者們也對CTC和ctDNA用于腫瘤診斷的效果進行了比較。在一項納入30例轉移性乳腺癌患者的研究中，ctDNA存在于97%的患者，而CTC的檢出率為87%[21]。一項采用ctDNA全基因組測序的跟蹤研究中納入了包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌的6例患者，采用不同抗癌方案治療，研究描繪了6例患者的突變率隨著時間的變化，顯示了ctDNA在全程監(jiān)控腫瘤演進中的作用[22]。

ctDNA作為HCC標志物的數(shù)據(jù)仍有限。有學者分析了ctDNA片段在血漿中的長度，并根據(jù)ctDNA數(shù)據(jù)推斷出組織DNA拷貝數(shù)的變異；證實了腫瘤來源的ctDNA短于非腫瘤來源的ctDNA。Jiang等[23]報道了2例先前未患HCC的HBV攜帶者，在患者血樣中發(fā)現(xiàn)存在異常DNA拷貝數(shù)，隨訪過程中這2例患者最終發(fā)展為HCC。提示檢測ctDNA拷貝數(shù)變異有可能成為HCC早期篩查的重要方法。

3.3 血清外泌體 外泌體是一類膜包裹的小囊泡(直徑30～120 nm)，由細胞主動釋放進入細胞外間隙或體液(如血液、尿液、膽汁或腹水)。外泌體包含細胞特異的蛋白質和核酸(包括mRNA、miRNA和其他非編碼RNA)。血清中外泌體的數(shù)量約為300萬/μL。細胞通過外泌體的穿梭往返在相鄰或遠隔細胞間傳遞信號，在細胞損傷和惡變等多種生理和病理過程中具有重要作用。腫瘤細胞可通過外泌體重新編碼鄰近健康細胞，促進腫瘤進展。

HCC腫瘤細胞能釋放高水平外泌體，在HCC形成過程中，癌細胞來源的外泌體介導細胞間miRNA的傳遞，從而調節(jié)受體細胞轉化生長因子β活化激酶-1(TAK1)的表達，促進細胞增殖；成人肝臟干細胞來源的外泌體含有腫瘤抑制性miRNA，能抑制HCC細胞的生長和存活；并能使荷瘤小鼠的HCC消退。外泌體介導的RNA和蛋白質交換，不僅在HCC發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，而且有可能成為實時非侵入性生物標志物和治療靶點。He等[24]對3個轉移性HCC細胞系進行蛋白質組學和RNA深度測序分析，發(fā)現(xiàn)HCC細胞產(chǎn)生的外泌體不同于正常細胞，前者富含致癌mRNA和蛋白質(如酪氨酸激酶受體MET、S100家族成員和小凹蛋白1和2)。同一作者還報道了通過細胞間外泌體傳遞，可激活PI3K/AKT和MAPK信號通路的分子，賦予非侵襲性肝細胞遷移能力。HCC細胞來源的外泌體通過激活HGF/c-Met/Akt信號通路和抑制凋亡，在腫瘤耐藥方面也具有關鍵作用[25]。需要注意的是，外泌體miRNA是循環(huán)miRNA的重要組成，前述HCC相關的外周血miRNA診斷標志物有可能來源于腫瘤細胞釋放的外泌體。

4 展望

外周血腫瘤標志物有助于HCC的早期診斷，但單一標志物的作用是有限的。為獲得更好的診斷靈敏度和特異度，可聯(lián)用不同種類的生物標志物，并與肝臟影像學檢查結合。另外，體液活檢血漿腫瘤DNA的獲得率仍較低，還存在與非腫瘤DNA交叉污染等問題，其解決方法有賴于實驗技術的進步。盡管HCC中發(fā)現(xiàn)了不少具有預后意義的新分子標志物，但目前仍缺乏能真正用于臨床的基因標記物。有些已發(fā)表的基因標志物僅包括數(shù)十個基因，操作方便，效率提高，也節(jié)約成本，但可能會影響檢測的靈敏度和準確性；有些研究形成的基因標志物高達數(shù)百個，檢測成本過高，也不便于臨床應用。我們?nèi)孕枥^續(xù)挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)，充分整合分析不同平臺數(shù)據(jù)，進一步評估這些標志物的診斷和預后價值。