陳君，徐孝飛

(1 解放軍第一一七醫(yī)院，浙江杭州 310000；2 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)

肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快的癌癥 ，如何精準(zhǔn)診斷肺癌成為當(dāng)前世界亟待解決的難題。液體活檢在癌癥中無創(chuàng)傷性早期診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測的作用給癌癥患者帶來了希望。目前，液體活檢能檢測各種循環(huán)癌癥生物標(biāo)志物，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)腫瘤DNA、循環(huán)miRNA等。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼的RNA小分子，長度19～25個(gè)核苷酸。miRNA首先在核內(nèi)被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成初級(jí)miRNA，再由Drosha-DGCR8加工形成60～100 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體miRNA，然后被核運(yùn)輸受體exportin-5和核蛋白R(shí)an-GTP運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，由Dicer再進(jìn)一步加工形成25 nt成熟miRNA[1]。miRNA可通過其靶基因調(diào)控下游細(xì)胞通路，影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等[2]。循環(huán)miRNA可能來源于損傷的組織、凋亡壞死的細(xì)胞以及細(xì)胞中的微囊泡，它穩(wěn)定存在于血清、血漿等體液中，在腫瘤疾病患者體內(nèi)和正常人的表達(dá)存在顯著的差異，因此循環(huán)miRNA可作為腫瘤預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，已有很多研究報(bào)道，miRNA在血液中檢測可發(fā)揮疾病診斷、患者預(yù)后評(píng)估、治療反饋的功能。

1 血液中循環(huán)miRNA的檢測技術(shù)

在肺癌中，循環(huán)miRNA檢測樣品主要是血漿或血清，由于樣品體積少，miRNA在血清或血漿中含量不高，后續(xù)選擇適合的檢測技術(shù)尤為重要。McDonald等[3]報(bào)道循環(huán)miRNA在血漿或血清中比較穩(wěn)定，但由于紅細(xì)胞內(nèi)也存在大量miRNA，血液樣品不及時(shí)處理會(huì)受到溶血影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果精確度不夠，因此選擇參照標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，采用外源添加的cel-miRNA-39-3p作為外參。另外，Guo等[4]專門比較了5種血清循環(huán)miRNA提取試劑盒(Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit，ThermoFisher Scientific Ambion TRIzol LS Reagent，Qiagen miRNEasy，QiaSymphony RNA extraction kit和Exiqon MiRCURY RNA Isolation Kit)提取小RNA的質(zhì)量，Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit獲取的miRNA變異性最佳，但Ambion TRIzol LS Reagent提取獲得的miRNA閱讀數(shù)百分比最高，各個(gè)提取試劑盒均有優(yōu)劣。

檢測循環(huán)miRNA的常規(guī)方法一般有兩種，基因芯片表達(dá)譜和PCR檢測?；蛐酒磉_(dá)譜檢測用于高通量篩選差異miRNA，PCR檢測則進(jìn)一步驗(yàn)證選定的miRNA是否有效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，對(duì)于血液中的miRNAs檢測，基于Q-PCR平臺(tái)的芯片(TaqMan ABI，miRCURY Exiqon)敏感性更高，而在血漿中低表達(dá)的miRNA，miRCURY的敏感性和準(zhǔn)確性優(yōu)于TaqMan平臺(tái)[5]。PCR檢測又細(xì)分為Q-PCR和ddPCR，但Q-PCR和ddPCR兩種方法檢測出來的肺癌循環(huán)miRNA結(jié)果并沒有很大區(qū)別[6]。此外，Gao等[7]研發(fā)了一種利用硅鈉米線場效應(yīng)的生物傳感器，可同時(shí)檢測miRNA-126和癌胚抗原的表達(dá)水平。

2 循環(huán)miRNA在肺癌中的診斷價(jià)值

肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩大基本類型，NSCLC又包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。目前，在各類肺癌中都有文獻(xiàn)報(bào)道循環(huán)miRNA可作為診斷指標(biāo)。

Shang等[8]發(fā)現(xiàn) miR-22在鱗癌患者血漿中表達(dá)高于正常人，miR-126在腺癌患者血漿中表達(dá)低于正常人，并且這兩個(gè)miRNA預(yù)測NSCLC發(fā)生的受試者工作特征曲線(ROC)中曲線下面積(AUC)均大于0.8，另外關(guān)于NSCLC轉(zhuǎn)移的ROC中AUC均大于0.7。Wang等[9]選取118例早期肺癌患者，48例中晚期肺癌患者和135例健康人血清進(jìn)行探針預(yù)測miRNA和Q-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p、miR-25和miR-126聯(lián)合診斷較為準(zhǔn)確，AUC在診斷早期肺癌時(shí)已達(dá)0.936。因此，多個(gè)miRNA作為生物標(biāo)志物來診斷肺癌發(fā)生，靈敏度和特異度高于單個(gè)miRNA，有更好的診斷精確性。

miRNA還可以和某些基因或蛋白聯(lián)合診斷肺癌發(fā)生。Roth等[10]通過35例NSCLC患者和7例良性肺部腫瘤患者以及28例正常人的血清比較，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中半胱天冬酶活性比正常人高,但又比良性肺部腫瘤患者低，還發(fā)現(xiàn)miR-10b、miR-141、miR-155在NSCLC患者血清中含量高于正常人和良性肺部腫瘤患者，AUC均大于0.7。

3 循環(huán)miRNA在肺癌中的預(yù)后評(píng)估價(jià)值

Wang等[11]使用全miRNA表達(dá)譜芯片測試長生存期(大于24月)NSCLC患者及短生存期(小于6月)患者，分析出140個(gè)高表達(dá)的miRNA，再通過生物信息學(xué)GO分析和miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫，篩選出與TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)的35個(gè)miRNA，進(jìn)一步用比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析生存期影響因素，得出17個(gè)miRNA與2年生存期有明顯關(guān)聯(lián)。其中miR-16表達(dá)在長短生存期中差異最大，長生存期與高表達(dá)的miR-16有關(guān)。進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分得出，高風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)患者比低風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)患者死亡率增加2.5倍，中位生存率減少7.8個(gè)月。

Rui等[12]根據(jù)SCLC能否安全接受放療條件分組，挑選22例局限期(LD)SCLC和50例廣泛期(ED)SCLC患者血清進(jìn)行miRNA芯片分析。結(jié)果顯示，miR-574-5p等4個(gè)miRNA在ED組中高于LD組，而miR-184和miR-4459則是LD組高于ED組。再進(jìn)一步用45對(duì)相應(yīng)的組織和血清進(jìn)行驗(yàn)證，體外驗(yàn)證選用H446和H2227細(xì)胞，得出miR-184通過抑制EPAS1基因從而抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制SCLC轉(zhuǎn)移侵襲，miR-574-5p抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)SCLC轉(zhuǎn)移侵襲。另有研究表明，miR-574-5p在A549、PC-9等NSCLC細(xì)胞中同樣具有抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲作用，但是miR-574-5p表達(dá)高低在75例患者無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存率(OS)上差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不是NSCLC預(yù)后因子[13]。SCLC和NSCLC中預(yù)后相關(guān)miRNA雖然可能具有同樣的生物學(xué)功能，但臨床上并不能通用。

4 循環(huán)miRNA在肺癌中的治療反饋功能

在放療方面，Sun等[14]通過80例Ⅱ～Ⅲ期接受放療局部晚期NSCLC患者血清miRNA表達(dá)譜檢測，篩選出11個(gè)miRNA預(yù)測放療劑量增減對(duì)OS的影響，建立了一種劑量反饋評(píng)分(DRS)的算法，可有效預(yù)測高劑量和標(biāo)準(zhǔn)劑量治療后患者的OS。低DRS的患者中，高劑量放療與標(biāo)準(zhǔn)劑量放療相比顯著改善OS，且大劑量放療也能降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。高DRS患者高劑量放射治療和標(biāo)準(zhǔn)劑量放療在OS上相似。

在化療方面，Li等[15]從60例NSCLC患者和30例正常人的血清miRNA比較中發(fā)現(xiàn),miR-210表達(dá)升高可作為NSCLC診斷依據(jù)，且根據(jù)36例接受2～3次鉑類化療的晚期NSCLC患者的療效反饋分析，穩(wěn)定和疾病進(jìn)展組患者比局部緩解組患者血清miR-210表達(dá)更高。Shi等[16]重點(diǎn)關(guān)注ⅢB期和Ⅳ期肺腺癌患者(無EGFR基因和ALK基因突變)培美曲塞聯(lián)合順鉑一線治療后單用培美曲塞維持治療情況，通過76例培美曲塞維持治療組和72例只接受最佳支持治療的觀察組患者血清miRNA譜比較發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-145、低表達(dá)miR-25和miR-210的培美曲塞維持治療人群具有較長的PFS。

在靶向藥物方面，Shen等[17]通過60例表皮生長因子受體(EGFR)突變患者和68例EGFR未突變患者血清miRNA表達(dá)譜檢測發(fā)現(xiàn),miR-21可作為吉非替尼治療反饋的預(yù)測因子，吉非替尼治療后降低了miR-21表達(dá)，患者獲得了更長的OS。此外，miR-10b在EGFR突變患者血清中含量高于未突變患者，且在進(jìn)展期表達(dá)高于疾病完全緩解或疾病穩(wěn)定期，但miR-10b表達(dá)與EGFR是否突變沒有相關(guān)性。

程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是最近癌癥免疫治療的熱點(diǎn)，目前還未有循環(huán)miRNA在PD-1或PD-L1治療前后的臨床血液miRNA監(jiān)測數(shù)據(jù)，但有文獻(xiàn)表明，miR-200家族、miR-34NA家族和miR-197在肺癌NSCLC細(xì)胞中與PD-L1有一定相關(guān)性[18]。

5 展望

目前，關(guān)于一些miRNA在血液中各組分中是否有表達(dá)已有相關(guān)數(shù)據(jù)庫(http://134.245.63.235/ikmb-tools/bloodmiRs)可查詢，但這些miRNA仍不全面，未能獲知miRNA在肺癌臨床中發(fā)揮了何作用。因此，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步試驗(yàn)歸納，獲得不同肺癌種類的最佳預(yù)測、預(yù)后、治療反饋功能特殊miRNA，用來作為生物標(biāo)志物，以達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pattarayan D, Thimmulappa RK, Ravikumar V, et al. Diagnostic potential of extracellular microRNA in respiratory diseases[J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2016，1(Suppl 1):1-13.

[2] Chen QY, Jiao DM, Wang J, et al. miR-206 regulates cisplatin resistance and EMT in human lung adenocarcinoma cells partly by targeting MET[J]. Oncotarget, 2016,7(17):24510-24526.

[3] McDonald JS, Milosevic D, Reddi HV, et al. Analysis of circulating microRNA: preanalytical and analytical challenges[J]. Clin Chem, 2011,57(6):833-840.

[4] Guo Y, Vickers K, Xiong Y, et al. Comprehensive evaluation of extracellular small RNA isolation methods from serum in high throughput sequencing[J]. BMC Genomics, 2017,18(1):50.

[5] Jensen SG, Lamy P, Rasmussen MH, et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs[J]. BMC Genomics, 2011,12(1): 435.

[6] Campomenosi P, Gini E, Noonan DM, et al. A comparison between quantitative PCR and droplet digital PCR technologies for circulating microRNA quantification in human lung cancer[J]. BMC Biotechnol, 2016,16(1):60.

[7] Gao A, Yang X, Tong J, et al. Multiplexed detection of lung cancer biomarkers in patients serum with CMOS-compatible silicon nanowire arrays[J]. Biosens Bioelectron, 2017,91:482-488.

[8] Shang AQ, Xie YN, Wang J, et al. Predicative values of serum microRNA-22 and microRNA-126 levels for non-small cell lung cancer development and metastasis: a case-control study[J]. Neoplasma, 2017,64(3):1-7.

[9] Wang P, Yang D, Zhang H, et al. Early detection of lung cancer in serum by a panel of microRNA biomarkers[J]. Clin Lung Cancer, 2015,16(4):313-319.

[10] Roth C, Kasimir-Bauer S, Pantel K, et al. Screening for circulating nucleic acids and caspase activity in the peripheral blood as potential diagnostic tools in lung cancer[J]. Mol Oncol, 2011,5(3):281-291.

[11] Wang Y, Gu J, Roth JA, et al. Pathway-based serum microRNA profiling and survival in patients with advanced stage non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res, 2013,73(15):4801-4809.

[12] Rui Z, Xiaoshu Z, Zhongyuan Y, et al. Tumor invasion and metastasis regulated by microRNA-184 and microRNA-574-5p in small-cell lung cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(42):44609-44622.

[13] Zhou R, Zhou X, Yin Z, et al. MicroRNA-574-5p promotes metastasis of non-small cell lung cancer by targeting PTPRU[J]. Sci Rep, 2016,6:35714.

[14] Sun Y, Hawkins PG, Bi N, et al. Serum MicroRNA signature predicts response to high-dose radiation therapy in locally advanced non-small cell lung cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2018,100(1):107-114.

[15] Li ZH, Zhang H, Yang ZG, et al. Prognostic significance of serum microRNA-210 levels in nonsmall-cell lung cancer[J]. J Int Med Res, 2013,41(5):1437-1444.

[16] Shi SB, Wang M, Tian J, et al. MicroRNA 25, microRNA 145, and microRNA 210 as biomarkers for predicting the efficacy of maintenance treatment with pemetrexed in lung adenocarcinoma patients who are negative for epidermal growth factor receptor mutations or anaplastic lymphoma kinase translocations[J]. Transl Res, 2016,170(2):1-7.

[17] Shen Y, Tang D, Yao R, et al. MicroRNA expression profiles associated with survival, disease progression, and response to gefitinib in completely resected non-small-cell lung cancer with EGFR mutation[J]. Med Oncol, 2013,30(4):750.

[18] Grenda A, Krawczyk P. New dancing couple: pd-l1 and microrna[J]. Scand J Immunol, 2017,86(3):130-134.