周艷華，茅 慧，張鵬飛，戴廣海

(解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活躍，其代謝機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，其中活躍的糖酵解代謝是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生化特征。惡性腫瘤細(xì)胞主要以碳水化合物通過(guò)糖酵解產(chǎn)能，而這一現(xiàn)象也被稱(chēng)為沃伯格效應(yīng)，該效應(yīng)是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中最根本的代謝改變之一[1]。這種代謝方式的轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?duì)糖酵解途徑進(jìn)行抑制靶向治療腫瘤細(xì)胞提供了可能性[2-3]。microRNA(miRNA)為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的非編碼小RNA，主要作用是調(diào)控基因的表達(dá)[4]。新近的研究顯示，miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑的異常調(diào)控是影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，促進(jìn)其快速生長(zhǎng)、增殖的重要原因之一，而miR-451作為抑癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-6]，其中miR-451在惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑中所起的調(diào)控作用尤其值得關(guān)注[7-8]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染來(lái)增強(qiáng)或抑制肝癌細(xì)胞中miR-451的表達(dá)，旨在探討miR-451對(duì)肝癌細(xì)胞糖酵解以及相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)的影響，為miRNA在腫瘤代謝方面的研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 主要材料與試劑

人肝癌細(xì)胞MHCC97購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma公司；DMEM F12培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)于Gibco公司；TIANscript RT Kit 購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) 購(gòu)自Ambion公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-451、U6引物序、miR-451 mimics和miR-451 inhibitors購(gòu)自Applera公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；XL-71臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Prism?7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將MHCC97細(xì)胞接種于DMEM F12 培養(yǎng)液(10%小牛血清+青霉素100 IU/mL +鏈霉素100 IU/mL)中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(孵育條件：37 ℃+5% CO2)； 0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為普通組、增強(qiáng)組和抑制組。將MHCC97細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h(細(xì)胞融合度達(dá)60%左右)后，增強(qiáng)組和抑制組按脂質(zhì)體Lipofectamine2000說(shuō)明進(jìn)行SP細(xì)胞miR-451 mimics和miR-451 inhibitors的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后采用RT-PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞中miR-451表達(dá)量。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為普通組、增強(qiáng)組和抑制組。將MHCC97細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)，平均每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下孵育4 h。終止反應(yīng)后棄上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(OD)，計(jì)算肝癌細(xì)胞增殖情況并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4肝癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為普通組、增強(qiáng)組和抑制組,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組AMPK/mTOR、Ki-67、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)表達(dá)情況。 ①細(xì)胞總RNA提取：采用Trizol法抽提濃縮組織RNA(每1×106～1×107細(xì)胞加入1 mL Trizol試劑)。Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)RNA分子完整性，NanoDrop@ ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度。② cDNA 合成：按照TIANscript RT Kit 的說(shuō)明進(jìn)行操作。反應(yīng)體系：Total RNA 40 μg,10×DNase I buffer 5 μL， RNase Inhibitor 20 IU，DNase I(RNase-free) 2 μL (10 IU)，加入RNase free dH2O至總體積50 μL。反應(yīng)條件：42 ℃反轉(zhuǎn)錄50 min，85 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。③ RT-PCR反應(yīng)：構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，即RT product 1 μL， 10 μmol/L 的PCR特異引物F 1 μL，10 μmol/L 的PCR特異引物R 1 μL，2×Master Mix 10 μL，Nucleasr-Free Water 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s。以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法分析檢測(cè)基因表達(dá)的相對(duì)定量值。

1.2.5葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為普通組、增強(qiáng)組和抑制組，將轉(zhuǎn)染前后MHCC97細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，3 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，取上清。按葡萄糖檢測(cè)試劑盒和乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)并計(jì)算各組MHCC97細(xì)胞葡萄糖消耗值和乳酸產(chǎn)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1

各組肝癌細(xì)胞中miR-451表達(dá)情況 普通組MHCC97細(xì)胞中miR-451的相對(duì)表達(dá)量為0.476±0.052，增強(qiáng)組MHCC97細(xì)胞中miR-451的相對(duì)表達(dá)量為1.153±0.242，明顯高于普通組(P<0.05)；抑制組MHCC97細(xì)胞中miR-451的相對(duì)表達(dá)量為0.284±0.030，明顯低于增強(qiáng)組(P<0.05)。

2.2

各組肝癌細(xì)胞增殖情況 3組轉(zhuǎn)染前OD值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。轉(zhuǎn)染24 h和48 h后，增強(qiáng)組OD值均明顯低于普通組和抑制組(P均<0.05)，抑制組OD值均明顯高于普通組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組轉(zhuǎn)染前后不同時(shí)間肝癌細(xì)胞增殖情況

注：①與增強(qiáng)組比較，P<0.05；②與普通組比較，P<0.05。

2.3

各組肝癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因表達(dá)情況 增強(qiáng)組肝癌細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)量明顯高于普通組和抑制組(P均<0.05)，而抑制組明顯低于普通組(P<0.05)；增強(qiáng)組肝癌細(xì)胞mTOR、Ki-67、MMP-9、VEGF和IGF-1 mRNA表達(dá)量均明顯低于普通組和抑制組(P均<0.05)，而抑制組均明顯高于普通組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4

各組肝癌細(xì)胞糖酵解情況 轉(zhuǎn)染前3組肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗值和乳酸分泌值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)組葡萄糖消耗值和乳酸分泌值均明顯低于轉(zhuǎn)染前及普通組和抑制組(P均<0.05)，抑制組葡萄糖消耗值和乳酸分泌值均明顯高于轉(zhuǎn)染前和普通組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 3組肝癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因表達(dá)情況

注：①與增強(qiáng)組比較，P<0.05；②與普通組比較，P<0.05。

表3 3組轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸分泌量比較

注：①與轉(zhuǎn)染前比較，P<0.05；②與增強(qiáng)組比較，P<0.05；③與普通組比較，P<0.05。

3 討 論

惡性腫瘤細(xì)胞存在明顯的能量代謝異常，而沃伯格效應(yīng)是目前公認(rèn)的惡性腫瘤細(xì)胞最重要的能量代謝特性，即在氧充足的條件下，腫瘤細(xì)胞無(wú)法通過(guò)線粒體氧化磷酸化方式獲取更多的能量，而只能通過(guò)糖酵解方式進(jìn)行葡萄糖代謝以滿(mǎn)足其活躍的合成代謝需求。沃伯格效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)為惡性腫瘤的治療提供了新的途徑和思路，即針對(duì)糖酵解途徑的靶向干預(yù)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝[9-10]。miRNA是普遍存在于真核細(xì)胞，具有高度保守序列的小RNA。目前已知miRNA在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝等生物學(xué)進(jìn)程中起著非常重要的調(diào)控作用[11]，其能夠?qū)μ墙徒庀嚓P(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)及活性異常，最終影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[12-13]。

miR-451為新近發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的小RNA，與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。Godlewski等[16]的研究顯示，miR-451在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，高葡萄糖條件下會(huì)使細(xì)胞miR-451表達(dá)增強(qiáng)，抑制AMPK功能，進(jìn)而抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖遷移；而當(dāng)葡萄糖缺乏時(shí)會(huì)激活A(yù)MPK信號(hào)，抑制miR-451表達(dá)，一方面增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力，另一方面增加對(duì)mTOR的抑制，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析提示miR-451 通過(guò)直接抑制靶基因CAB39的表達(dá)，進(jìn)而抑制LKB1/AMPK信號(hào)傳導(dǎo)。本研究中，通過(guò)脂質(zhì)體miR-451 mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染來(lái)增強(qiáng)和抑制肝癌細(xì)胞miR-451的表達(dá)，結(jié)果顯示增強(qiáng)miR-451表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞增殖，減少肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗值和乳酸分泌值；抑制miR-451表達(dá)則促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，會(huì)增加肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗值和乳酸分泌值。提示過(guò)表達(dá)miR-451會(huì)抑制肝癌細(xì)胞糖酵解，抑制miR-451表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞糖酵解。

miR-451能夠通過(guò)抑制糖酵解來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是其涉及的信號(hào)通路和基因目前尚未明確。AMPK/mTOR通路是已知的調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和能量代謝的一條重要的信號(hào)途徑[17]。mTOR基因活化能夠促進(jìn)細(xì)胞糖酵解，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，AMPK則負(fù)向調(diào)控mTOR的功能。當(dāng)細(xì)胞能量缺乏時(shí)，AMP/ATP比例升高，激活A(yù)MPK并磷酸化形成TSC1/2二聚體，抑制mTOR活性[18-19]。Ki-67、MMP-9、VEGF和IGF-1是目前公認(rèn)的癌基因，這些指標(biāo)高表達(dá)提示腫瘤生長(zhǎng)增殖活躍，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且Ki-67、MMP-9、VEGF和IGF-1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與糖酵解過(guò)程中的信號(hào)通路存在密切相關(guān)性[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，增強(qiáng)miR-451表達(dá)后肝癌細(xì)胞中mTOR、Ki-67、MMP-9、VEGF和IGF-1 mRNA表達(dá)量明顯降低，而AMPK mRNA表達(dá)量明顯增高；抑制miR-451表達(dá)后肝癌細(xì)胞中mTOR、Ki-67、MMP-9、VEGF和IGF-1 mRNA表達(dá)量增高，而AMPK mRNA表達(dá)量明顯降低。提示miR-451可能通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR傳導(dǎo)通路以及細(xì)胞中Ki-67、MMP-9、VEGF、IGF-1的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞代謝途徑，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)增殖的作用。

綜上所述，miR-451參與調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖糖酵解，其調(diào)控機(jī)制可能通過(guò)影響AMPK/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞中Ki-67、MMP-9、VEGF、IGF-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。未來(lái)可以針對(duì)腫瘤糖酵解相關(guān)miRNAs進(jìn)行靶向性研究來(lái)干預(yù)腫瘤細(xì)胞能量代謝，進(jìn)而為腫瘤的治療提供新的途徑和思路。

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