傅金瑞 王高升 王學(xué)超 張超 張晨磊 王廣舜 劉金波
乳腺癌是指發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,是女性常見(jiàn)的腫瘤之一[1],而浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是乳腺癌中最為多見(jiàn)的病理類型。研究發(fā)現(xiàn),是否有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是制定浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌治療方案的重要參考依據(jù)[2]。本研究采用雙向凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MELDI-TOF-MS)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移兩組浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的血清蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析,尋找與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的血清蛋白標(biāo)志物,有助于深入解析其病理過(guò)程,以及臨床對(duì)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是否發(fā)生腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作出及時(shí)準(zhǔn)確的鑒定。
孟子云:“天將降大任于斯人也,必先苦其心志,勞其筋骨,餓其體膚,空乏其身,行拂亂其所為?!笨喽谎裕亲屛覀冹o靜地蛻變,待到時(shí)運(yùn)際遇,一鳴而天下驚。
美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)專利許可政策演進(jìn)考察............................................................................................楊正宇 03.88
1.1 一般資料 收集2015年3月—2016年5月本院收治的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者血清樣本24份,其中確診發(fā)生及未發(fā)生腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本各12份?;颊呔鶠榕?;年齡44~65歲,平均(54.5±10.5)歲;均未接受手術(shù)、放療或化療;具有可比性?;颊哂谇宄靠崭钩檠o置20 min,以3 500 r/min離心15 min。用EP管分裝500 μL血清,編號(hào)后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)等量混合每組樣本。
1.2 試劑和儀器 尿素、CHAPS(美國(guó)Bio-Rad公司);蛋白定量染液(美國(guó)Thermo Scientific公司);乙腈CAN(美國(guó)Merck公司);三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA,美國(guó)DIMA公司);胰蛋白酶(Trypsin Gold,美國(guó)Promega公司);基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸、碳酸氫銨(美國(guó)Fluka公司);硫脲、血清高豐度蛋白去除試劑盒、2-D Clean-up及2-D Quant試劑盒(美國(guó)Sigma公司);等電聚焦儀(美國(guó)Bio-Rad公司),型號(hào)為 PROTEANIEF;Ettan DALT Six電泳系統(tǒng)、ImageScanner掃描儀、LabScan軟件(美國(guó)Amersham公 司);MALDI-TOF-MS儀、Flex Control軟件、BioTools軟件(美國(guó)Bruker公司);Maccot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索軟件(英國(guó)Matrix Science公司)。
2.2 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析 經(jīng)過(guò)對(duì)被標(biāo)記差異蛋白點(diǎn)的切取與酶解,將處理好的肽段送入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。將質(zhì)譜分析得到的PMF數(shù)據(jù)通過(guò)MASCOT蛋白質(zhì)檢索軟件進(jìn)行蛋白檢索,選擇Swiss-port數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索參數(shù)為:肽片段分子質(zhì)量容許誤差100 ppm;固定修飾為脲甲基半胱氨酸,可變修飾為氧化。除去高豐度蛋白,共鑒定出5種高可信度蛋白質(zhì),分別是表達(dá)上調(diào)的T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T-lymphoma invasion and metastasisinducing protein 1,Tiam1)、組織蛋白酶 K(cathepsin K,CatK)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物 3(actin-related protein complex subunit 3,ARPC3)以及表達(dá)下調(diào)的抑癌蛋白Necdin。圖2為T(mén)iam1肽指紋譜,表1為所篩選差異蛋白的鑒定結(jié)果。
不同規(guī)模的事務(wù)所對(duì)于從業(yè)人員的要求也不盡相同。一般情況來(lái)說(shuō),規(guī)模大的會(huì)計(jì)師事務(wù)所對(duì)從業(yè)人員的專業(yè)素質(zhì)與職業(yè)經(jīng)歷比較看重,而中小會(huì)計(jì)師事務(wù)所在這些方面一般要求會(huì)弱化一些。特別是對(duì)于大多數(shù)的會(huì)計(jì)師事務(wù)所而言,專業(yè)性人才還比較缺乏,如信息技術(shù)人員、行業(yè)專家等,由于這類人才的缺失,大型會(huì)計(jì)師事務(wù)所的服務(wù)水平很有限,盡管所內(nèi)人員履歷豐富,但是年齡、創(chuàng)新意識(shí)及業(yè)務(wù)水平專一是其潛在問(wèn)題。
1.3.1 樣品蛋白的處理 采用血清高豐度蛋白去除試劑盒去除血清樣品的白蛋白和免疫球蛋白,采用2-D Clean-up試劑盒去除鹽、脂肪、多糖等干擾雙向電泳的物質(zhì),接著用2-D Quant試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定(實(shí)驗(yàn)步驟均按照說(shuō)明書(shū)操作),分裝后-80 ℃冰箱凍存。
1.3.3 凝膠圖譜掃描與分析 利用掃描儀將凝膠進(jìn)行投射掃描后,使用Image Master 2D Platinum凝膠分析系統(tǒng)依次進(jìn)行凝膠位點(diǎn)檢測(cè)、背景消減匹配等分析,篩選標(biāo)記蛋白點(diǎn)。
1.3.2 2D-PAGE 取300 μg蛋白樣品與水化液混合至450 μL,上樣24 cm IPG膠條進(jìn)行第一向電泳,程序設(shè)定為:30 V,12 h;100 V,1 h;1 000 V, 1 h;8 000 V,5 h;2 000 V,8 h。等電聚焦結(jié)束后,將 IPG膠條置于平衡緩沖液中15 min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入垂直電泳槽中進(jìn)行第二向電泳。后用考馬斯亮藍(lán)G-250對(duì)電泳凝膠進(jìn)行染色。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.3.4 差異蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋分析及鑒定 挖取差異蛋白質(zhì)點(diǎn),蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解后獲得酶解肽段,打開(kāi)Flex control軟件,將樣品板放入質(zhì)譜儀,用Auto run的方法進(jìn)行樣品分析。肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF)用Flex analysis軟件標(biāo)峰,Biotool軟件搜庫(kù)。
2.1 2D-PAGE圖譜及其分析 對(duì)兩組樣本總蛋白分別進(jìn)行3次電泳,3次電泳結(jié)果相似,選擇清晰度高且點(diǎn)數(shù)多的膠作為參考膠,進(jìn)行兩組間的匹配分析,獲得人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及無(wú)轉(zhuǎn)移組血清樣本的電泳圖譜。用掃描儀投射掃描后,利用凝膠圖像分析軟件對(duì)兩組樣本總蛋白進(jìn)行凝膠位點(diǎn)檢測(cè)、背景消減和匹配等分析處理,篩選標(biāo)記出差異2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)11個(gè),留做下一步的質(zhì)譜鑒定,見(jiàn)圖1。
1.3 方法
圖1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(S1)與無(wú)轉(zhuǎn)移組(C1)的凝膠圖譜
表1 5種高可信度差異蛋白的鑒定結(jié)果
對(duì)于乳腺癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,國(guó)內(nèi)外均已做了較為廣泛的探討。高永生等[6]對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織蛋白進(jìn)行了2D-PAGE以及MALDI-TOF-MS技術(shù)質(zhì)譜鑒定,篩選出了可能參與乳腺癌浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程的Ezrin、Stathmin等蛋白。侯巍巍等[8]對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織及癌旁正常乳腺組織行2D-PAGE及質(zhì)譜分析,篩查出了在癌組織中高表達(dá)的熱休克蛋白27、70、90,認(rèn)為其有可能成為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的聯(lián)合特異性標(biāo)記物。Boccardo等[9]同樣利用MALDI-TOF-MS技術(shù)篩選出了血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang- Ⅱ),其血清濃度可作為乳腺癌,尤其是術(shù)后患者病死率的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。
圖2 T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tiam1)的肽指紋譜
與20世紀(jì)普遍的“異病同藥”理論不同,近年來(lái)腫瘤個(gè)性化治療的理念越來(lái)越深入人心,針對(duì)不同類型腫瘤的靶向性藥物日益增多,或者說(shuō)大部分藥物尤其是新近開(kāi)發(fā)的藥物被要求量型而用,極大提高了腫瘤治療的質(zhì)量[3]。對(duì)于傳統(tǒng)的乳腺癌標(biāo)志物,如人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)的研究已經(jīng)取得了較大的成就,臨床上能夠用赫賽汀等靶向藥物有效治療HER2過(guò)度表達(dá)和基因擴(kuò)增的乳腺癌患者[4]。再如對(duì)Ezrin蛋白的研究發(fā)現(xiàn),其廣泛參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附、侵襲轉(zhuǎn)移以及新生血管發(fā)生的調(diào)節(jié)過(guò)程,并且該蛋白對(duì)某些非腫瘤疾病也具有很大的臨床價(jià)值[5-6]。所以要想精準(zhǔn)治療,就要繼續(xù)尋找各種類型的腫瘤,甚至同一種類型腫瘤中不同病理類型或分期病例所特有的靶標(biāo),即蛋白標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)如MALDI-TOF-MS技術(shù),在蛋白標(biāo)志物篩查中具有相對(duì)質(zhì)高價(jià)廉的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的研究過(guò)程[7],被證實(shí)是較為前沿而實(shí)用的技術(shù)之一。本研究即采用該技術(shù)篩查腋淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的標(biāo)志蛋白。
《中國(guó)造紙》除及時(shí)報(bào)道各研究機(jī)構(gòu)、高等院校在科研理論方面取得的突破成果外,還注重報(bào)道各制漿造紙廠引進(jìn)或自行研究探索的新工藝、新技術(shù)?!吨袊?guó)造紙》將理論與實(shí)踐有機(jī)結(jié)合,更好地滿足了科研工作者以及制漿造紙工廠技術(shù)人員的需要。《中國(guó)造紙》是我國(guó)造紙界權(quán)威性技術(shù)期刊,連續(xù)入選“中文核心期刊”“中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊”“中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源期刊”“中國(guó)科學(xué)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)來(lái)源期刊”,入選“中國(guó)科協(xié)精品科技期刊工程第四期項(xiàng)目”,并已被Scopus、CA等國(guó)外著名的期刊索引收錄。
浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌約占乳腺癌的3/4,惡性程度較高,并且在發(fā)現(xiàn)時(shí)半數(shù)左右已有淋巴或血行轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響了患者的手術(shù)效果以及5年或10年生存率,而腋淋巴結(jié)狀況是制定浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌治療方案的重要參考依據(jù),是浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌獨(dú)立的預(yù)后影響因子[10-11]。因此,本研究在綜合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,利用2D-PAGE以及MALDI-TOF-MS技術(shù),對(duì)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的血清蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了篩選鑒定。
以八個(gè)半綜合征為表現(xiàn)的橋腦出血合并Wernicke腦病1例報(bào)告 …………… 袁偉杰,李桂心,鄧德旺 408
本研究中,兩組的血清經(jīng)過(guò)了2D-PAGE和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定并與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了比對(duì)分析,從11個(gè)差異蛋白點(diǎn)中篩查出5個(gè)潛在的蛋白標(biāo)志物。其中Tiam1、CatK以及Necdin蛋白已有文獻(xiàn)報(bào)道與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān);VEGF-B已有與其他腫瘤關(guān)系的報(bào)道;ARPC3尚未見(jiàn)與腫瘤關(guān)系的報(bào)道。
Tiam1是二磷酸鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(guanosine diphosphate,GDP)與三磷酸鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(guanosine triphosphate,GTP)的轉(zhuǎn)換因子,即鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF),已證實(shí)其表達(dá)與乳腺癌的惡性程度及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子[12]。CatK是一種半胱氨酸蛋白酶,在破骨細(xì)胞的間接骨吸收中有較強(qiáng)的溶解膠原的活性,在惡性黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá),在皮膚和肺的成纖維細(xì)胞中也有表達(dá),而在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腺癌、結(jié)直腸腺癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)均為陰性[13]。但另有報(bào)道稱,CatK表達(dá)于骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中,其抑制劑L-235能夠顯著抑制裸鼠人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[14]。VEGF-B能促進(jìn)血管新生,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。作為血管重塑因子,Yang等[15]發(fā)現(xiàn)VEGF-B能夠經(jīng)由異于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)的作用機(jī)制促進(jìn)黑色素瘤及肺鱗癌的轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致患者的存活率降低。Necdin蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma associated antigens,MAGE)超家族成員,是一個(gè)以p53為目標(biāo)并調(diào)節(jié)其生物功能的生長(zhǎng)抑制因子。Lee等[16]發(fā)現(xiàn),與過(guò)表達(dá)變異型Necdin的鼠乳腺腫瘤細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)野生型Necdin的侵襲性和肺轉(zhuǎn)移功能顯著減弱。肌動(dòng)相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體(actinrelated protein 2/3,ARP2/3)是一種肌動(dòng)蛋白裝配蛋白,可以促進(jìn)細(xì)胞板狀偽足中的肌動(dòng)蛋白聚集、裝配,推動(dòng)細(xì)胞移動(dòng)。Kinoshita等[17]發(fā)現(xiàn)其亞單位5(ARPC5)在頭頸部鱗癌組織的表達(dá)明顯高于非癌組織。沉默或抑制ARPC5在人舌癌細(xì)胞系HSC3的表達(dá),可以引起細(xì)胞微絲骨架的重組及細(xì)胞形態(tài)的圓球樣改變,細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移功能明顯受到抑制。同樣,Rauhala等[18]的實(shí)驗(yàn)顯示,沉默肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物亞單位4(ARPC4)的表達(dá)能夠顯著降低胰腺癌細(xì)胞系Hs700T和HPAFII的遷移能力。但尚未見(jiàn)ARPC3與腫瘤細(xì)胞關(guān)系的報(bào)道。
總之,伴有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌在血清蛋白表達(dá)上存在很多差異,提示乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程是多種蛋白共同作用的結(jié)果,尋找其中的主要蛋白,可以作為判斷其轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物,也有助于闡明其發(fā)生轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制。限于條件,本研究所收集的血清樣本數(shù)量較少,后續(xù)工作應(yīng)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
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