王建福，雷趙民，萬學瑞，姜輝，李潔，吳建平*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

青貯是提高玉米(Zeamays)秸稈利用率并有效保存其營養(yǎng)價值的重要手段。在青貯發(fā)酵的微生物體系中，同質發(fā)酵乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸可以使環(huán)境pH值迅速降低，從而抑制其他有氧細菌、酵母菌和霉菌的生長，減少其他有機酸的生成量，從而減少青貯營養(yǎng)損失并保證青貯品質[1]。玉米秸稈上所附著的乳酸菌數(shù)量往往不足，導致發(fā)酵后pH值下降緩慢，腐敗菌生長期延長，營養(yǎng)物質損失增加[2]。通過添加外源乳酸菌，使其在青貯發(fā)酵系統(tǒng)中形成優(yōu)勢菌群，產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低pH值并抑制其他腐敗菌的生長，對保存青貯營養(yǎng)價值具有重要作用[3]。CaCO3、纖維素酶、淀粉酶和尿素在青貯中的應用均有報道：CaCO3不僅可以補充飼料中鈣含量，而且可以中和青貯中的酸，提高發(fā)酵產(chǎn)物的適口性[4]；淀粉酶和纖維素酶可以增加青貯發(fā)酵中的可溶性糖的濃度，為乳酸菌發(fā)酵的迅速啟動提供充足底物，以促進發(fā)酵[5]；尿素不但可以為微生物發(fā)酵提供氮源，提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量和營養(yǎng)價值，其本身還可以直接作為反芻動物飼料中的非蛋白氮添加劑[6]。在前期的試驗中篩選出了5株具有提高青貯發(fā)酵品質并抑制二次發(fā)酵潛力的乳酸菌[7]，為了檢測其混合菌液及其與CaCO3、纖維素酶、淀粉酶和尿素等復合制劑對全株玉米青貯發(fā)酵促進和營養(yǎng)成分保存的作用過程和效果，通過檢測發(fā)酵過程中不同添加組合青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質的變化，為玉米秸稈青貯調制及乳酸菌復合制劑研制提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

蠟熟期收獲的全株玉米為2016年10月由臨洮縣華加牧業(yè)有限公司提供，干物質含量約29%～33%；腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)B2-3、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B3-1、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E2-3均由本實驗室分離鑒定并保存, 乳酸菌用Modified Sholtens’ Broth (MSB)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調濃度為1×109cfu·mL-1，按5 mL·kg-1青貯原料添加，即5×106cfu·g-1，不添加菌液組添加等體積的MSB液體培養(yǎng)基；CaCO3和尿素為分析純試劑；纖維素酶酶活20000 U·g-1，α-淀粉酶酶活3700 U·g-1；秸稈粉碎機(9Z-9A型青貯鍘草對輥揉搓型)由洛陽四達農(nóng)機有限公司生產(chǎn)；相關儀器還包括聚乙烯真空包裝袋(22 cm×28 cm)及真空包裝機；相關發(fā)酵品質及營養(yǎng)成分檢測設備由甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院實驗室提供。

1.2 試驗設計

試驗共設置8個組，其中1個空白對照組(CK)，1個復合乳酸菌對照組(B)，6個處理組(Bca、BU、BCA、BCaCA、BCAU、BCaCAU)，見表1。每組設置3個重復，每袋裝樣量為0.5 kg，真空包裝后室溫保存。

表1 試驗設計Table 1 The design of experiment

1.3 測定方法

按常規(guī)法[8]測定青貯飼料的干物質(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)和粗脂肪(ether extract，EE)含量； 采用Van Soest等[9]的方法測定酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)；按照Dubois等[10]的方法測定水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量；液相色譜法(Waters ACQUITY UPLC，色譜柱BEH C18 1.0 mm×50 mm, 1.7 μm，流動相為水和0.3%磷酸甲醇，流速為0.1 mL·min-1，檢測波長210 nm，進樣量5 μL)測定青貯中的乳酸(lactic acid，LA)和乙酸(acetic acid，AA)；苯酚-次氯酸鈉比色法[11]測定NH3-N；取青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，組織搗碎機均勻搗碎后紗布過濾，pH計測定濾液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS Statistic 19.0軟件包進行單因素ANOVA方差分析和Duncan氏多重比較，試驗結果采用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵前玉米秸稈營養(yǎng)成分

青貯前全株玉米粉碎后的DM含量為28.86%，CP含量為7.73%，EE含量為3.47%，WSC含量為14.92%，NDF含量為52.17%，ADF含量為26.13%。原料的可溶性糖類含量和含水量符合青貯飼料調制要求。

2.2 全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產(chǎn)物品質

全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產(chǎn)物品質如表2所示。發(fā)酵3 d，BCAU組LA含量最高，顯著高于除BCaCA組和BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，B組含量最低；BCa組AA含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，B組含量最低；B組LA/AA最高，BCa組最低，但差異不顯著(P>0.05)；BCaCA組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于除CK和B組之外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最高；B組pH值顯著低于其他各組(P<0.05)，BCa組和BCaCA組pH值較高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

發(fā)酵10 d，BCAU組LA含量最高，顯著高于除BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，CK組含量最低；CK組AA含量最低，顯著低于除B組之外的其他各組(P<0.05)，BCa組含量最高；CK組LA/AA最高，BCa組最低，但差異不顯著(P>0.05)；BCaCA組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于除CK組和BCa組外的其他各組(P<0.05)，BCAU組氨態(tài)氮含量最高；CK組pH值最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，BCaCA組最高。

發(fā)酵30 d，BCa、BCaCA、BCAU和BCaCAU組LA含量均較高，顯著高于其他各組(P<0.05)，CK組最低；CK組AA含量最低，顯著低于除B組和BCA組外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最高；BCaCA組和BCAU組LA/AA最高，BU組最低，但差異不顯著(P>0.05)；B組氨態(tài)氮含量最低，顯著低于BU組、BCAU組和BCaCAU組(P<0.05)，BU組含量最高；B組pH值最低，顯著低于除CK組之外的其他各組(P<0.05)，BCaCA組最高。

2.3 全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產(chǎn)物化學成分

全株玉米青貯發(fā)酵不同時期產(chǎn)物化學成分如表3所示。發(fā)酵3 d，BU組CP含量最高，顯著高于除BCaCAU組的其他各組(P<0.05)，BCaCA組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa組外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最低；B組ADF含量最低，顯著低于除CK、BU和BCA組之外的其他各組(P<0.05)，BCa組含量最高；B組NDF含量最低，顯著低于除CK、BU、BCA和BCaCA組之外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最高；BCA組的WSC含量最高，顯著高于除CK、B、BCAU和BCaCAU組外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最低。

發(fā)酵10 d，BCaCAU組的CP含量最高，顯著高于除BCAU組外的其他各組(P<0.05)，BCaCA組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa組之外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最低；ADF和NDF各組均無顯著差異(P>0.05)；BCA組WSC含量最高，顯著高于除CK組和B組之外的其他各組(P<0.05)，BCaCAU組含量最低。

表2 不同添加物對全株玉米青貯發(fā)酵不同時間產(chǎn)物品質變化影響Table 2 Fermentation quality of corn silage in different time with different inoculant

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

Note: The different lowercase letters in the same column mean significant differences atP<0.05, the same or no letter mean no significant differences atP>0.05. The same below.

發(fā)酵30 d，BCaCAU組CP含量最高，顯著高于除BU組之外的其他各組(P<0.05)，CK組含量最低；BCaCA組EE含量最高，顯著高于除BCa、BCA和BCAU組外的其他各組(P<0.05)，BU組含量最低；B組ADF含量最低，但除顯著低于BCaCAU組之外(P<0.05)，與其他各組差異均不顯著(P>0.05)；各組NDF差異均不顯著(P>0.05)；CK組WSC含量最高，顯著高于除B和BCA組外的其他各組(P<0.05)，BCAU組含量最低。

3 討論

3.1 復合乳酸菌對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

乳酸菌可以分為同質發(fā)酵乳酸菌和異質發(fā)酵乳酸菌，同質發(fā)酵往往僅產(chǎn)生乳酸，青貯的品質較高，營養(yǎng)成分損失較少[12]，但青貯取用后的有氧穩(wěn)定性往往較差，在實際生產(chǎn)中使用并不理想。異質發(fā)酵過程除了產(chǎn)生乳酸之外，還產(chǎn)生乙酸、甘露醇甚至乙醇等物質，發(fā)酵過程的營養(yǎng)和能量損失往往較大，但乙酸等可以抑制有害菌的生長， 使取用后的青貯有氧穩(wěn)定性增強[13]。所以，在青貯實際使用的乳酸菌制劑中，往往既有同質發(fā)酵乳酸菌也有異質發(fā)酵乳酸菌，并添加其他青貯促進或不利發(fā)酵抑制物質。本試驗所使用的5株乳酸菌中，戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1和屎腸球菌B5-2屬于同質發(fā)酵乳酸菌，腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7和發(fā)酵乳桿菌E2-3屬于異質發(fā)酵乳酸菌。從5株菌復合物的添加效果來看，其提高了30 d發(fā)酵LA和AA的產(chǎn)量以及LA/AA比例，降低了氨態(tài)氮和pH值，提高了30 d發(fā)酵產(chǎn)物的CP、EE，降低了ADF和NDF含量，提高了全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質。但從時間上來看，發(fā)酵過程中的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化是復雜的，趨勢并不完全一致，所以，還需要對發(fā)酵過程中微生物種類和數(shù)量的變化及其發(fā)酵的底物和產(chǎn)物進行綜合分析來揭示復合添加物對發(fā)酵品質變化的影響機制。

表3 不同添加物對全株玉米青貯發(fā)酵不同時間產(chǎn)物化學成分變化的影響Table 3 Chemical composition of corn silage in different time with different inoculant (%DM)

3.2 復合乳酸菌和CaCO3復合添加對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

從本試驗結果可見，CaCO3的添加提高了青貯過程中的LA和AA的產(chǎn)量，可以提高青貯產(chǎn)物中的總酸產(chǎn)量，其中對AA的增加作用較大，降低了LA/AA比例，提高了發(fā)酵的pH值以及氨態(tài)氮的含量。隨著發(fā)酵時間的延長，CaCO3除了能進一步顯著提高LA和AA產(chǎn)量外，還可以提高LA/AA的比例，從而提高青貯發(fā)酵品質。在30 d發(fā)酵后，CaCO3與乳酸菌復合添加組LA含量相比單獨的復合乳酸菌添加組及空白對照組分別提高了26%和30%；AA含量相比單獨的復合乳酸菌添加組和空白對照組分別提高了35%和37%。AA對真菌具有較好的抑制作用，所以AA含量的提高對提高青貯產(chǎn)物的有氧穩(wěn)定性是有利的。Pejin等[14]在啤酒糟的發(fā)酵過程中添加CaCO3分別使添加發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組LA產(chǎn)量增加了13%和17%。Li等[15]發(fā)現(xiàn)在玉米青貯中添加CaCO3能夠快速的產(chǎn)生LA，發(fā)酵3 d的LA產(chǎn)量已經(jīng)比對照組高出3倍，同時也提高了AA的產(chǎn)量。本試驗中發(fā)酵3 d添加CaCO3組也獲得了較高的LA產(chǎn)量，但AA產(chǎn)量增幅更大。

郭天龍等[16]發(fā)現(xiàn)在甜菜(Betavulgaris)青貯發(fā)酵中添加CaCO3可使WSC含量降低，而對其他營養(yǎng)成分含量無影響，而本試驗發(fā)現(xiàn)，CaCO3的添加提高了玉米秸稈青貯的CP和EE含量，有提高ADF和NDF的趨勢，降低了WSC的含量?？赡苁且驗榕c單獨添加復合乳酸菌相比，添加CaCO3進一步促進了復合乳酸菌以及其他菌類的發(fā)酵，利用了發(fā)酵底物WSC，增加了微生物的含量所致。Santos等[17]在甘蔗(Saccharumofficinarum)青貯試驗中也發(fā)現(xiàn)添加復合乳酸菌不能使青貯營養(yǎng)成分含量提高，但是添加CaCO3提高了發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)價值。本試驗中，復合乳酸菌和CaCO3復合添加對進一步促進青貯發(fā)酵具有顯著效果，并且隨著發(fā)酵時間的延長，EE、ADF、NDF有增加的趨勢，WSC有降低的趨勢。

3.3 復合乳酸菌和尿素復合添加對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

尿素作為一種含氮物質，在玉米青貯過程中可以顯著提高CP含量，彌補玉米秸稈本身蛋白含量的不足[18]。但也有研究認為，青貯中添加尿素會使LA/AA比例降低，氨態(tài)氮含量增加，降低青貯發(fā)酵品質[19]。本研究中，復合乳酸菌和尿素的復合添加提高了青貯料氨態(tài)氮的含量及pH值，LA/AA比例下降，但LA和AA的含量均高于空白對照組和復合乳酸菌單獨添加組，尤其是AA含量的增加明顯。發(fā)酵產(chǎn)物中增加的氨態(tài)氮含量主要由添加的尿素產(chǎn)生，反芻動物瘤胃中本身也可以利用這種非蛋白氮，而且尿素作為氮源，促進了青貯過程中發(fā)酵菌的生長，進一步提高了蛋白含量，發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸具有抑制霉菌等有害菌的作用，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的有氧穩(wěn)定性，降低青貯取用后的二次發(fā)酵損失[20]。

3.4 復合乳酸菌和纖維素酶、淀粉酶復合添加對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

纖維素酶和淀粉酶可以分解秸稈中的纖維素和淀粉，為青貯發(fā)酵提供更多的可溶性糖類底物，從而促進青貯發(fā)酵過程，尤其是當發(fā)酵底物中的WSC含量不足時，這種作用更加顯著[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在全株玉米青貯中添加復合乳酸菌和兩種酶制劑在發(fā)酵3 d時，可以顯著提高LA和AA的產(chǎn)量，但隨著發(fā)酵時間的延長，這種作用變弱，并且與對照組和復合乳酸菌單獨添加組差異變得不顯著。隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶和淀粉酶的添加可以進一步增加AA產(chǎn)量，降低LA/AA比例，更有利于提高青貯發(fā)酵產(chǎn)物的有氧穩(wěn)定性。纖維素酶和淀粉酶與復合乳酸菌的復合添加沒有使全株玉米青貯發(fā)酵過程中的營養(yǎng)品質有所改善，CP、EE、ADF、NDF以及WSC與對照組和復合乳酸菌單獨添加組相比差異均不顯著。但與添加CaCO3和復合乳酸菌組以及尿素和復合乳酸菌組相比，顯著提高了發(fā)酵產(chǎn)物的WSC含量，進一步體現(xiàn)了多種添加劑組合可能對乳酸菌發(fā)酵的促進作用。但是可能由于全株玉米青貯原料的可溶性糖類含量豐富，兩種酶對可溶性糖類的增加作用有限[22-23]。

3.5 復合乳酸菌、CaCO3、尿素與纖維素酶和淀粉酶的復合添加對全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質變化的影響

復合乳酸菌、CaCO3和兩種酶的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產(chǎn)量，提高EE含量和pH值，降低WSC含量，并且在所測定的時間內這種趨勢是持續(xù)的?？梢?，同時添加復合乳酸菌、CaCO3和兩種酶有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，也有利于改善發(fā)酵產(chǎn)物的適口性[24]。復合乳酸菌、兩種酶和尿素的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產(chǎn)量，提高發(fā)酵產(chǎn)物的氨態(tài)氮含量、pH值和CP含量，降低WSC含量，在所測定的時間內LA和AA產(chǎn)量、pH值及WSC含量的變化趨勢是持續(xù)的，氨態(tài)氮和CP含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢?？梢姡瑫r添加復合乳酸菌、兩種酶和尿素有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，尤其是可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的CP含量，也有利于改善發(fā)酵產(chǎn)物的適口性。復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素的復合添加可以增加全株玉米青貯發(fā)酵的LA和AA產(chǎn)量，提高發(fā)酵產(chǎn)物的氨態(tài)氮含量、pH值和CP含量，降低WSC含量，在所測定的時間內LA和AA產(chǎn)量、氨態(tài)氮含量、pH值及CP含量的變化趨勢是持續(xù)的，WSC含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢?？梢姡瑫r添加復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素有利于促進青貯發(fā)酵，提高全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質，也有利于改善發(fā)酵產(chǎn)物的適口性。同時添加CaCO3、尿素和兩種酶組CP隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，而EE、ADF、NDF和WSC均表現(xiàn)出了先降低后增加的趨勢，可見微生物發(fā)酵在3～30 d期間活躍且復雜[25]，而相關的機理尚需進一步通過研究不同微生物組成及產(chǎn)物和底物變化的特點來闡明。綜合比較，同時添加復合乳酸菌、CaCO3、兩種酶和尿素組30 d后發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質最好。

4 結論

5株乳酸菌混合劑的添加可以提高全株玉米青貯發(fā)酵的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質；同時添加CaCO3和復合乳酸菌能進一步增加青貯的LA和AA產(chǎn)量，尤其是AA產(chǎn)量，防止pH值過分降低，也有提高青貯營養(yǎng)品質的趨勢；同時添加尿素和復合乳酸菌能進一步提高青貯的AA和氨態(tài)氮的含量，防止pH值過分降低，顯著提高CP含量，從而提高青貯營養(yǎng)品質；纖維素酶和淀粉酶可以提高發(fā)酵產(chǎn)物的WSC含量，提高LA和AA的產(chǎn)量，提高青貯發(fā)酵品質；CaCO3、尿素、纖維素酶、淀粉酶和復合乳酸菌的添加對全株玉米青貯的發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質的提高效果最好；全株玉米青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)品質在前3 d變化最快，發(fā)酵不同階段不同添加組合的變化不盡一致。

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