高璇
(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,山東濟(jì)南250000)
細(xì)胞色素P450廣泛地分布在動物、植物和微生物中。P450在高等植物的微粒體、液泡膜、線粒體膜等中大量存在,其中在微粒體中的含量最高。植物的各器官中,葉片中含有的細(xì)胞色素P450最高,其次是花朵、莖中。植物細(xì)胞色素P450對植物本身有著非常多作用,有助于植物新陳代謝,合成或分解激素,還能抵御生物以及非生物脅迫,用于合成花粉孢粉素等。
1969年,D.S.Frear等人首次在棉花中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450,隨后在更多的植物中發(fā)現(xiàn)了P450,如小麥、水稻中[1]。根據(jù)現(xiàn)階段的研究成果,P450的基因數(shù)目占據(jù)了物種總基因數(shù)目的1%,說明了細(xì)胞色素P450基因的多樣化。小麥作為我國主要的糧食作物之一,在生長過程中,P450基因發(fā)揮著重要的作用,能提升小麥的抗逆性,豐富其抗性基因資源。參照以往的小麥細(xì)胞色素P450研究成功,發(fā)現(xiàn)小麥P450能解毒和促進(jìn)代謝和氧化等。Cabello-Hurtado等人從小麥中提取了編碼鈍葉醇的CYP51基因,酵母中表達(dá)該基因,能增強(qiáng)羊毛甾去甲基化的活性[2]。Forthoffer等人研究認(rèn)為,有3個及以上的P450參與了除草機(jī)解毒過程,除草劑的毒性能提升P450的活性[3]。小麥中的一個P450基因和赤霉病的抗性也有著密切的聯(lián)系,這個P450基因在抗性品種中的表達(dá)量非常高,說明P450基因?qū)τ谛←溄舛竞头烙鹬e極的效應(yīng)。
本次研究材料選擇某小麥品種,使用Trizol試劑盒,RACE試劑盒(美國Invitrogen公司),從Fermentas公司購入反轉(zhuǎn)錄試劑,另外試驗用到的Ex Taq酶、pMD18-T載體從Transgen公司購入。
2.2.1 提取小麥基因組DNA和總RNA
使用Trizol方法提取小麥葉片中的RNA,使用CTAB方法提取基因組中的DNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得出完整的cDNA鏈,并將其在-20℃的環(huán)境下保存。
2.2.2 克隆TaP450基因
使用已知的小麥P450基因序列在數(shù)據(jù)庫中搜索,將得出的序列進(jìn)行拼接比對,獲取到68個Contig,選出和已知小麥P450基因差異較大的序列研究。研究中將該拼接序列作為模板,并設(shè)計引物TaP450-S和TaP450-A,其中TaP450-S的序列為5'-CCTCTTCCTGCTCCACTACA-3';TaP450-A 引 物的 序 列 為5'-GCCTTATTACGCCAACAACGC-3'[4]。用小麥葉片cDNA作為模板進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。在94℃下預(yù)變性5min,94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸1.5min,75℃延伸10min,對目的條帶連接pMD18-T載體進(jìn)行測序,依照測試結(jié)果設(shè)計5'-RACE引物和3'-RACE引物,進(jìn)行RACE擴(kuò)增,連入pMD18-T進(jìn)行載體測序,拼接獲得TaP450基因的全長cDNA序列。
2.2.3 TaP450基因生物信息學(xué)分析和基因組序列克隆
使用ExPASy軟件,對TaP450基因編碼蛋白的分子量等進(jìn)行分析。在對Ta基因組序列進(jìn)行克隆時,以小麥葉片中基因組DNA作為模板,使用引物TaP450-gS(序列:5'-AGAAGAGATGAACCACGAA-3')以及TaP450-gA(序列:5'-GCCTTATTACGCCAACAAGC-3')進(jìn)行PCR的擴(kuò)增,反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,53℃時退火30s,72℃時延伸5min,30個循環(huán),72℃時延伸10min。將擴(kuò)增片段連入到pMD18-T載體進(jìn)行測序,從而獲得TaP450的基因組序列[5]。
2.2.4 TaP450組織特異性表達(dá)和脅迫處理表達(dá)
將小麥葉子、莖部、根部以及種子的總RNA提取,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用小麥Actin基因為內(nèi)參,檢測TaP450在小麥不同部位的相對表達(dá)量。對TaP450進(jìn)行脅迫處理時,選用狀態(tài)一致小麥,使用200mmol/L的NaCl浸泡24h,20%的PEG6000浸泡24h,用100μmol/L的ABA葉面噴施,恢復(fù)生長24h。損傷葉子恢復(fù)生長24h。提取葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,檢測TaP450在多種脅迫下的相對表達(dá)量[6]。
2.2.5 半定量RT-PCR檢測
用小麥的Actin作為內(nèi)參,使用TaActin-S(序列:5'-AGCCATACCGTGCCAATC-3')和引物TaActin-A(序列:5'-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3'),反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,經(jīng)過28個循環(huán)后在72℃下延伸10min,根據(jù)TaP450基因設(shè)計引物TaP450-RTS(序列:5'-ATGTCAGAGGAGGCCCAGGAGTTCA-3')和引物TaP450-RTA(序列:5'-ATGTCAGAGGAGGC CCAGGAGTTCA-3'),實施組織器官表達(dá)和脅迫處理表達(dá),反應(yīng)程序在94℃下預(yù)變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,經(jīng)過28個循環(huán)后72 ℃延伸 10min。
PCR擴(kuò)增后得到長為1546bp的目的條段,這片段序列和拼接序列大致相同,存在3個堿基差異。對5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增后將三條序列拼接,得到長為2033bp的DNA片段,這個片段有長度為1557bp的開放讀碼框,有polyA尾[7]。
TaP450基因編碼蛋白中的氨基酸數(shù)量有518個,分子量是57.092kD,等電點是8.63。TaP450蛋白N端有長度29的氨基酸跨膜結(jié)構(gòu)和長度22的氨基酸信號鈦。通過分析得出該蛋白是分泌蛋白,和已知的P450蛋白比對,該蛋白和已知的P450蛋白的氨基酸序列不同,存在著很大差異,序列相似性低。
用小麥基因組DNA作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長度為2643bp的DNA片段。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)基因組序列中有長度為1086 bp的內(nèi)含子,兩個外顯子的長度分別為942bp和615bp。
經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn),TaP450基因在小麥中的多個部位都有表達(dá),其中在小麥的葉片中的表達(dá)量最高,在小麥的根部的表達(dá)量較低。脅迫表達(dá)分析方面,設(shè)置了不同的脅迫條件,對不同環(huán)境下TaP450表達(dá)量變化作出了檢測。通過對檢測結(jié)果的研究,發(fā)現(xiàn)TaP450在受到鹽、機(jī)械損傷后,表達(dá)量出現(xiàn)明顯的上調(diào)。經(jīng)過PEG6000以及冷處理時,表達(dá)量的變化不明顯[8]。對比得出結(jié)論,說明TaP450基因?qū)}、機(jī)械損傷等比較的敏感,對冷處理等不敏感。不同脅迫處理后,發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)}脅迫最為敏感,得出TaP450基因和鹽脅迫的關(guān)系密切。
P450作為一種氧化酶,有著強(qiáng)大的功能,能促進(jìn)小麥的新陳代謝,并有著解毒的功效。本次研究中從小麥中提取了一個新的P450基因——TaP450,這個新的TaP450基因和已知的P450基因存在著較大的差異性,并且TaP450基因在小麥的各個部位都有表達(dá),其中在小麥的葉片和頸部的含量最高,在種子以及根部的表達(dá)量較低。受到多種環(huán)境脅迫時,發(fā)現(xiàn)TaP450基因?qū)C(jī)械損傷在鹽脅迫下的表達(dá)量上調(diào)較為明顯,其中以在鹽脅迫下的表達(dá)最為顯著,說明了TaP450基因和逆境脅迫相關(guān)。研究中,TaP450基因在水楊酸處理下上調(diào),表明了該基因在一定程度上能增強(qiáng)小麥的抗病性。通過對小麥的蛋白序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)TaP450蛋白N端的信號鈦,證明了屬于分泌蛋白。對TaP450基因的克隆和表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)了新的P450成員,為增強(qiáng)小麥的抗逆性提供了幫助。