張 強(qiáng)， 李 彬， 李曉光， 游國(guó)超， 高 毅

兔VX2腫瘤模型制作方法多種多樣，種植方式有開腹法及CT或超聲導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺種植法，瘤源包括細(xì)胞懸液或組織塊。開腹種植法創(chuàng)傷較大，細(xì)胞懸液種植法靶器官外種植轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，CT或超聲導(dǎo)引下組織塊種植法是目前常用的兔VX2腫瘤模型制作方法［1-2］。文獻(xiàn)報(bào)道中多采用空芯穿刺針穿刺兔肝臟/腎臟，再經(jīng)針尾將VX2組織塊用針芯推入，存在植入組織塊碎裂、大小不一、拔針時(shí)組織塊移位、成瘤大小和位置均質(zhì)性差等問(wèn)題。為此，本研究對(duì)傳統(tǒng)組織瘤塊種植法進(jìn)行改良，體外將浸潤(rùn)少量對(duì)比劑的明膠海綿條、腫瘤組織塊逆向預(yù)裝入穿刺針內(nèi)，然后在CT導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺靶器官，穿刺針到位后將組織塊和明膠海綿條“一步”推送植入，較傳統(tǒng)方法便捷省時(shí)、孤立成瘤率高。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新西蘭大白兔26只，雌雄不限，體重2～3 kg，由北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；VX2瘤株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供。設(shè)備及器材包括前瞻性掃描2013型CT機(jī)（德國(guó) Siemens公司）、Infinix-i INFX-8000 V 型DSA機(jī)（日本Toshiba公司）、16 G 8.5 cm種植穿刺針、一次性胸穿刺包（佛山特種醫(yī)用導(dǎo)管公司）、18 G穿刺套管針針芯（頭端磨平，作為種植穿刺針針芯）（美國(guó)Angiotech公司）、明膠海綿（廣州市快康醫(yī)療器械公司）、2%利多卡因（5 mL：1 g，中國(guó)大冢制藥公司）、3%戊巴比妥（美國(guó)Sigma公司）、肝素鈉（2 mL：12 500 U，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥公司）、碘海醇注射液（350 mg I/mL，通用電氣藥業(yè)上海公司）。

1.2 種兔制作和組織塊體外預(yù)裝

將已凍存VX2瘤株組織迅速置于37℃水浴內(nèi)融化、快速?gòu)?fù)蘇，低溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量磷酸緩沖液（PBS）搖勻，制成細(xì)胞懸液備用。取VX2細(xì)胞懸液1 mL接種于腫瘤傳代兔后腿外側(cè)最厚肌肉群內(nèi)，2周后觀察接種部位是否可觸及腫塊，并作增強(qiáng)CT掃描，進(jìn)一步確認(rèn)荷瘤兔制備是否成功。

3%戊巴比妥（1 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈麻醉荷瘤兔，腫塊處備皮消毒，無(wú)菌條件下取出腫塊，切開、去除中心壞死組織，取邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚肉樣組織，用手術(shù)刀片切割成約l.0 mm×1.0 mm×3.0 mm組織塊，置于無(wú)菌0.9%NaCl溶液中備用。將明膠海綿塊修剪為1.5 mm×1.5 mm×3.0 mm長(zhǎng)條狀數(shù)條備用；取無(wú)菌16 G 8.5 cm胸穿刺針，剪除尾端連接管；將18 G穿刺針針芯頭端磨平，消毒備用，于距離針芯頭端 9.5 cm處作一標(biāo)記。將明膠海綿條沿長(zhǎng)軸捻動(dòng)壓縮，經(jīng)穿刺針頭端逆向填入針腔內(nèi)約3 cm，用1 mL注射器抽取對(duì)比劑0.3 mL，注入穿刺針針腔內(nèi)將明膠海綿條浸潤(rùn)；用注射器針頭挑取腫瘤組織塊1條，經(jīng)穿刺針頭端逆向填入針腔內(nèi)，將組織塊完全填入（組織塊頭端距離針尖斜面0.5～1 cm）；用無(wú)菌0.9%NaCl溶液紗布將穿刺針頭端擦拭5～10次，去除針尖表面可能殘留的腫瘤細(xì)胞，完成組織塊預(yù)裝，備用（圖 1）。

1.3 兔VX2肝/腎腫瘤模型制作

圖1 “體外預(yù)裝示蹤一步植入技術(shù)”

兔VX2肝腫瘤模型——實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈用3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上，腹部備皮，消毒鋪巾；CT掃描定位穿刺點(diǎn)，設(shè)計(jì)進(jìn)針路線，取肝左葉外側(cè)段為預(yù)接種部位；1%利多卡因2 mL作穿刺點(diǎn)局部麻醉，切開穿刺點(diǎn)皮膚約5 mm，用預(yù)裝穿刺針沿預(yù)先設(shè)計(jì)進(jìn)針路線穿刺入1.5～2 cm，CT掃描確定針尖部位，使之位于肝左葉實(shí)質(zhì)中部；位置合適后經(jīng)穿刺針尾端緩慢推送針芯至標(biāo)記處并保留30 s，隨后緩慢旋轉(zhuǎn)并整體拔出穿刺針，穿刺點(diǎn)按壓1 min，再次消毒。術(shù)后即刻CT掃描確定高密度明膠海綿位置，預(yù)判種植部位。兔VX2腎腫瘤模型——實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，俯臥位固定于操作臺(tái)上，背部備皮，消毒鋪巾，CT掃描定位穿刺點(diǎn)，設(shè)計(jì)進(jìn)針路線，取腎下極為種植部位；1%利多卡因2 mL作穿刺點(diǎn)及穿刺針道局部麻醉，切開穿刺點(diǎn)皮膚約5 mm，用預(yù)裝穿刺針沿預(yù)先設(shè)計(jì)進(jìn)針路線穿刺入2～2.5 cm，CT掃描確定針尖部位，使之位于腎下極內(nèi)；位置合適后經(jīng)穿刺針尾端緩慢推送針芯至標(biāo)記處并保留30 s，隨后緩慢旋轉(zhuǎn)并整體拔出穿刺針，穿刺點(diǎn)按壓1 min，再次消毒。術(shù)后即刻CT掃描確定高密度明膠海綿位置，預(yù)判種植部位。

術(shù)畢記錄植瘤時(shí)間（局部麻醉開始至拔針完成所用時(shí)間）。實(shí)驗(yàn)兔自然清醒，送動(dòng)物房飼養(yǎng)。2周后作增強(qiáng)CT掃描檢查，明確有無(wú)腫瘤生長(zhǎng)，并與預(yù)判種植部位對(duì)比，明確腫瘤生長(zhǎng)部位與預(yù)接種部位是否一致。3周后再次CT增強(qiáng)掃描檢查，明確腫瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)。取兩模型實(shí)驗(yàn)兔各1只作肝、腎腫瘤組織學(xué)檢查，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。后續(xù)經(jīng)兔隱動(dòng)脈入路分別行肝、腎腫瘤栓塞［3］，觀察肝、腎VX2腫瘤造影表現(xiàn)。

1.4 隨訪觀察

接種后2周對(duì)種兔模型作CT平掃和增強(qiáng)掃描（管電壓 80 kVp，管電流 120 mAs，層厚 2 mm，矩陣512×512，照射野150 mm）——肝臟3期掃描，動(dòng)脈期延遲6 s，門靜脈期31 s，延遲期37 s；腎臟2期掃描，動(dòng)脈期延遲8 s，延遲期31 s——對(duì)比劑經(jīng)22 G靜脈留置針經(jīng)耳緣靜脈注入（劑量1 mL/kg，速率1.5 mL/s，壓力100 psi）。將CT成像傳送至Syngo工作站，分別檢測(cè)腫瘤矢狀面、橫斷面及冠狀面最大徑，采用“Oncology”及“Volume”軟件測(cè)定不同層面徑線，記錄腫瘤體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2只實(shí)驗(yàn)種兔制作均成功，2周后種植部位可觸及腫塊，質(zhì)硬。CT見種植部位肌肉內(nèi)類圓形強(qiáng)化腫塊，直徑約1.5 cm，周邊強(qiáng)化明顯。肝腫瘤接種10只兔，接種均獲成功，無(wú)感染及死亡發(fā)生；植瘤時(shí)間3.5～5.5 min，平均4.3 min。腎腫瘤接種10只兔，接種成功9只（9/10），無(wú)感染及死亡發(fā)生。植瘤時(shí)間4.3～6.5 min，平均 4.9 min。

肝腫瘤生長(zhǎng)區(qū)與對(duì)比劑標(biāo)記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。2周CT平掃表現(xiàn)為肝內(nèi)單發(fā)類圓形低密度病灶，動(dòng)脈期周邊環(huán)狀強(qiáng)化，門靜脈期腫瘤周邊強(qiáng)化環(huán)密度逐漸減低，呈向心性強(qiáng)化趨勢(shì)，但不能完全使病灶強(qiáng)化，平衡期瘤周強(qiáng)化環(huán)密度進(jìn)一步減低，中心可見未強(qiáng)化低密度區(qū)；3周病變明顯增大，強(qiáng)化特點(diǎn)與2周時(shí)相同，但中心未強(qiáng)化區(qū)明顯增大（圖2①～③）；4周出現(xiàn)肝肺轉(zhuǎn)移播散。隨訪期間無(wú)穿刺針道及肝外種植轉(zhuǎn)移發(fā)生，DSA檢查表現(xiàn)為肝內(nèi)單發(fā)病變，類圓形，病變周邊染色明顯（圖2④）。組織學(xué)檢查顯示腫瘤細(xì)胞核大深染，侵犯鄰近正常肝組織（圖2⑤）。VX2肝腫瘤徑線及體積變化見表1。

腎腫瘤生長(zhǎng)區(qū)與對(duì)比劑標(biāo)記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。2周時(shí)CT平掃腫瘤輪廓顯示不清，動(dòng)脈期表現(xiàn)為腎下極單發(fā)占位性病變，強(qiáng)化不明顯，表現(xiàn)為腎皮質(zhì)連續(xù)性中斷或皮質(zhì)缺損；延遲掃描腫瘤邊界清楚、密度較腎實(shí)質(zhì)低、類圓形，周邊輕度強(qiáng)化，中心強(qiáng)化不明顯，占位效應(yīng)明顯，鄰近腎盞受壓變形，重建圖像顯示病變位于腎實(shí)質(zhì)內(nèi)，未突破腎包膜；3周病變明顯增大，占位效應(yīng)明顯，中心未強(qiáng)化區(qū)擴(kuò)大，腫瘤突破腎皮質(zhì)外生（圖3①～③）；4～5周腫瘤突破腎包膜，侵犯鄰近筋膜并出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。DSA檢查表現(xiàn)為腎下極實(shí)質(zhì)內(nèi)染色缺損區(qū)，占位效應(yīng)明顯（圖3④）；組織學(xué)檢查顯示2周時(shí)腫瘤細(xì)胞核大深染，瘤組織未突破腎包膜（圖3⑤）。VX2腎腫瘤徑線及體積變化見表2。

圖2 VX2肝腫瘤種植影像及組織學(xué)隨訪結(jié)果

表1 VX2肝腫瘤徑線及體積隨時(shí)間變化 ±s

表1 VX2肝腫瘤徑線及體積隨時(shí)間變化 ±s

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表2 VX2腎腫瘤徑線及體積隨時(shí)間變化 ±s

表2 VX2腎腫瘤徑線及體積隨時(shí)間變化 ±s

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3 討論

圖3 VX2腎腫瘤種植影像及組織學(xué)隨訪結(jié)果

VX2腫瘤模型種植方法多種多樣［4-13］。既往多采用細(xì)胞懸液法制備，但操作過(guò)程繁瑣，最主要是易發(fā)生轉(zhuǎn)移和針道種植，使造模失敗，故不適合介入放射學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。目前多采用組織塊種植法，其簡(jiǎn)便，易于成瘤，孤立成瘤率較高。開腹種植法創(chuàng)傷較大，而腹腔鏡種植法需要專門器械及操作技能。因此，影像設(shè)備導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺組織塊種植法是目前常用造模方法［7-8，10，12］。

既往報(bào)道影像導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺組織塊種植法多采用“后裝技術(shù)”，即穿刺針到位后再將組織塊及明膠海綿塊經(jīng)穿刺針尾部緩慢推入。但該方法有以下缺點(diǎn)：組織塊在針腔內(nèi)移行距離長(zhǎng)，與針腔內(nèi)壁摩擦，可能損傷部分組織；“后裝技術(shù)”耗時(shí)且不便捷，裝填組織塊時(shí)需要固定穿刺針，穿刺針隨實(shí)驗(yàn)兔呼吸可能在體內(nèi)移位，從而使種植部位發(fā)生移位，特別是對(duì)體積相對(duì)小的臟器如腎臟，更易發(fā)生穿刺針移位，導(dǎo)致植瘤失敗。為此，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)該方法，采用“體外預(yù)裝示蹤一步植入技術(shù)”——先體外逆向?qū)⒚髂z海綿條填入穿刺針內(nèi)，并用對(duì)比劑浸潤(rùn)明膠海綿，起示蹤作用，后再逆行填入修剪好的組織塊1條于針腔內(nèi)，預(yù)裝完成后反復(fù)擦拭穿刺針尖部，去除表面可能殘留的組織塊碎屑或細(xì)胞。采用預(yù)裝好的穿刺針直接穿刺，穿刺針到位后可快速將組織塊推送入靶器官，耗時(shí)明顯減少，且組織塊在針腔內(nèi)移行距離明顯縮短，降低了組織塊損傷及組織碎屑脫落概率，進(jìn)而降低移位種植風(fēng)險(xiǎn)。

與VX2肝腫瘤模型近似，超聲及CT導(dǎo)引下組織塊種植法也是較為理想的VX2腎腫瘤模型制作方法［13-16］，成瘤率為 40%～100%［17-18］。由于腎臟較肝臟小，影像導(dǎo)引下種植較肝臟困難，準(zhǔn)確判定針尖位置至關(guān)重要；CT較超聲有較高的組織分辨率和空間分辨率，采用CT導(dǎo)引下組織塊種植，即刻CT掃描即可顯示腫瘤種植部位是否理想。本實(shí)驗(yàn)?zāi)I腫瘤種植成瘤率90%（9/10），均為單發(fā)成瘤，無(wú)腎外種植發(fā)生，2周腫瘤主要位于腎實(shí)質(zhì)內(nèi)。因此，該方法是理想的兔VX2腫瘤模型制作方法。

本實(shí)驗(yàn)采用 “體外預(yù)裝示蹤一步植入技術(shù)”制作兔VX2肝/腎腫瘤模型，優(yōu)點(diǎn)在于腫瘤組織塊已預(yù)裝好，穿刺針位置理想后即可用針芯推送，可減少穿刺針在體內(nèi)滯留時(shí)間及移位概率，縮短手術(shù)時(shí)間，術(shù)后可即刻了解腫瘤種植部位，便捷有效；結(jié)果顯示腫瘤生長(zhǎng)區(qū)與對(duì)比劑標(biāo)記的高密度明膠海綿區(qū)基本一致。浸潤(rùn)對(duì)比劑的明膠海綿條既起到示蹤作用，又可封堵穿刺針道，防止出血和組織塊在拔針時(shí)移位于靶器官外，發(fā)生種植轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采用大小長(zhǎng)度基本一致的單一組織塊種植，與既往報(bào)道相比增加了組織塊長(zhǎng)度，未增加組織塊數(shù)量，結(jié)果均可成瘤，且為孤立種植瘤，2～3周隨訪無(wú)靶器官外種植轉(zhuǎn)移。種植瘤大小和位置均一性好，更加適合進(jìn)行肝/腎腫瘤經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞或經(jīng)皮消融實(shí)驗(yàn)研究。

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