藍(lán) 琳,喻 芬,黃明敏,孟祥賢

(湖南大學(xué)生物學(xué)院,中國湖南長沙410082)

miRNA是一種由18～25個成熟核苷酸(nt)組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,由pre-miRNA(precursor microRNA)剪切而來,廣泛存在于各種真核生物中。1993年,Ambros課題組在研究線蟲時首次發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在[1]。

隨著真核生物的不斷進(jìn)化,miRNA仍舊保持著它具有的三大特色,即保守性、組織特異性和時序性[2]。近期研究報道,miRNA在一系列的生命活動過程中具有不可替代的作用,當(dāng)體內(nèi)miR-195含量過度表達(dá)時,會導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病和心機(jī)梗死等疾病的發(fā)生[2]；當(dāng)體內(nèi)的某些miRNA表達(dá)下調(diào)時,機(jī)體會更容易罹患癌癥和其他一系列疾病。這些現(xiàn)象提示,可通過對miRNA進(jìn)行定量檢測來實(shí)現(xiàn)對相關(guān)疾病的早期診斷。與此同時,在腫瘤的判別和血細(xì)胞生成等重要的生理過程中,miRNA也作為一種重要調(diào)控物質(zhì)參與其中[3]。因此,探索有效并且適用的miRNA定量分析技術(shù)對生命的各項生理活動均具有重要意義。成熟miRNA片段本身具有兩個不可規(guī)避的缺點(diǎn):片段小,而且沒有poly(A)尾巴。這導(dǎo)致其在定量檢測過程中會遇到如下難題[4]:1)miRNA的序列不穩(wěn)定,容易降解；2)家族成員間具有很高的相似性,同一家族的miRNA在序列上僅僅只相差1～2個堿基；3)各種細(xì)胞在不同時期的表達(dá)水平都有差異,但是普遍偏低；4)miRNA前體中包含miRNA序列,對檢測的特異性容易造成干擾。為了攻克這4個難題,科學(xué)家們近年來發(fā)現(xiàn)并建立了多種miRNA定量檢測技術(shù)[5],這些技術(shù)具有4個主要的特點(diǎn):簡潔快速、高通量、靈敏度高以及好的特異性。本文從檢測出發(fā),著重綜述了基于雜交、擴(kuò)增和測序原理的三大技術(shù)在miRNA檢測中的研究進(jìn)展,并闡述了miRNA的研究方法及其方向。

1 基于雜交原理的檢測技術(shù)

1.1 印跡雜交檢測

RNA印跡法(Northern blotting)是 miRNA檢測技術(shù)中最早建立的雜交檢測方法之一。其通?？梢苑譃?個過程:1)提取樣本的總RNA,親和層析法分離純化miRNA,然后通過甲醛變性將miRNA進(jìn)一步按大小分離,并通過溴化乙淀染色檢測質(zhì)量；2)轉(zhuǎn)膜。尼龍膜帶有正電荷,對帶有負(fù)電荷的核酸具有很高的親和性,在熱和紫外線的作用下,尼龍膜和miRNA之間會形成共價鍵,從而起到固定作用；3)雜交顯影檢測。印跡雜交技術(shù)一直被視為miRNA檢測和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。但這個方法存在一些缺點(diǎn),比如:勞動力密集、費(fèi)時間、樣品用量大(10～30 μg)、靈敏度低(檢測限為納摩爾級別)、檢測效率低等[6],限制了該技術(shù)的廣泛使用。為了克服傳統(tǒng)印跡雜交技術(shù)的上述缺點(diǎn),人們在經(jīng)典印跡雜交技術(shù)上衍生了多種改進(jìn)方法,如:引入鎖核酸(locked nucleic acid,LNA),由于LNA與miRNA具有高親和力,采用LNA修飾的核苷酸探針可以使印跡雜交檢測靈敏度顯著提高10倍[7]；使用可溶性的碳二亞胺(EDC),實(shí)現(xiàn)miRNA與尼龍膜的高效交聯(lián),與傳統(tǒng)的UV交聯(lián)法相比,miRNA檢測靈敏度提高25～30倍[5]。

1.2 原位雜交檢測

原位雜交檢測miRNA是首先將目標(biāo)miRNA固定在細(xì)胞中,再利用堿基互補(bǔ)配對的原理和探針雜交,最后可以使用免疫組織化學(xué)法對靶物質(zhì)miRNA進(jìn)行檢測。Kerstens等[8]結(jié)合鎖核酸技術(shù)和酪酰胺信號放大技術(shù)(tyramide signal amplification,TSA),發(fā)展了高效的原位雜交方法,顯著提高了檢測靈敏度,使低豐度miRNA實(shí)現(xiàn)原位可視化。目前,原位雜交方法已被開發(fā)用于檢測冰凍切片中的miRNA。例如Silahtaroglu[9]課題組建立了基于熒光原位雜交(miRNA FISH)技術(shù)的冰凍切片中miRNA檢測方法,并指出該方法對染色體的鑒定和miRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位及其在不同時間和空間上的積聚分布等研究領(lǐng)域有重要作用。熒光原位雜交方法已經(jīng)逐步實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床miRNA樣品檢測,Schepeler等[10]通過檢測大腦發(fā)育過程中prognostic miRNA含量的變化,判定結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險,做到及時干預(yù)治療。

1.3 微陣列芯片和微球技術(shù)的高通量檢測

微陣列芯片技術(shù)是在一塊芯片上,構(gòu)建多個靶物質(zhì)互補(bǔ)的探針序列,將靶物質(zhì)與芯片孵育雜交,然后沖洗去除沒有雜交部分,掃描芯片,最后對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,從而實(shí)現(xiàn)miRNA快速高通量檢測。但是芯片上不同的探針分子和待測分子之間容易發(fā)生交叉反應(yīng),該方法具有靈敏度低、特異性不好、重復(fù)性差等缺點(diǎn)[11]。基于微球雜交建立起來的流式細(xì)胞檢測方法克服了微陣列芯片的上述不足[12]。每個微球相當(dāng)于微陣列芯片上的一個點(diǎn),與傳統(tǒng)芯片相比,微球處于液相懸浮狀態(tài),其表面固定的探針更有利于捕獲待測靶miRNA序列,可有效避免固態(tài)芯片中的交叉反應(yīng),使檢測具有更好的重復(fù)性和特異性。

2 基于擴(kuò)增原理的檢測技術(shù)

2.1 RT-PCR擴(kuò)增法

RT-PCR擴(kuò)增法是通過實(shí)時熒光PCR儀對核酸進(jìn)行檢測的一種技術(shù)手段。其過程為先將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的互補(bǔ)DNA(cDNA),隨后進(jìn)行普通的實(shí)時熒光PCR。該方法以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板,可以實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的定量實(shí)時檢測。

然而,由于miRNA序列短(18～25 nt),僅為一條PCR引物的長度,常規(guī)的RT-PCR檢測方法對miRNA檢測具有很大的局限性。因此,國內(nèi)外科研工作者對傳統(tǒng)的RT-PCR方法進(jìn)行改善,建立了加尾法以及莖環(huán)法等檢測miRNA的方法,達(dá)到對miRNA的快速靈敏檢測。加尾法通常有兩種方法:第一種是利用末端轉(zhuǎn)移酶將poly(A)尾巴加在miRNA分子的3′末端,進(jìn)而延長miRNA,得到長的cDNA[13],以這個長的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測；第二種方法主要是設(shè)計特定的長的探針,該探針3′端與miRNA的5′端部分互補(bǔ),從而以miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成一條更長的cDNA,以這個cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測[14]。我們實(shí)驗(yàn)室在通用莖環(huán)法基礎(chǔ)上,設(shè)計了一種誘導(dǎo)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的線性探針,將其作為RT-PCR的特異性探針來檢測let-7家族,與已有文獻(xiàn)相比,具有更低的背景,并且檢測靈敏度和特異性更好。

2.2 等溫擴(kuò)增法

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)雖然達(dá)到了對miRNA進(jìn)行高靈敏檢測的水平,但是該方法對溫度有精確的要求,且對設(shè)備也有一定的要求。目前,一系列不需要精確控溫的等溫擴(kuò)增技術(shù)已被相繼研發(fā)[15～19],尤其是滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)和指數(shù)擴(kuò)增(exponential amplification reaction,EXPAR)兩類技術(shù),在miRNA檢測中具有明顯優(yōu)勢。

2.2.1 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種在體外實(shí)施的、溫度恒定的檢測核酸的擴(kuò)增方法,該方法以環(huán)狀DNA分子為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增[15]。滾環(huán)擴(kuò)增方法的主要優(yōu)勢在于溫度恒定并且無需復(fù)雜儀器等。2006年,Jonstrup等[16]首次發(fā)現(xiàn)滾環(huán)擴(kuò)增可以實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測。在這個過程中,miRNA起到了兩個作用,首先是作為模板,在DNA連接酶的作用下,將掛鎖探針連接成環(huán)狀；其次是作為引物,在聚合酶的作用下對整個反應(yīng)進(jìn)行聚合延伸放大。其擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳的方式進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測分析。此后,科學(xué)家們探索出了一系列的改良方法,檢測的靈敏度和特異性得到進(jìn)一步提高。Cheng等[17]利用T4 RNA連接酶2連接環(huán)化鎖探針,通過熒光染料對反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測,檢出miRNA下限為10 fmol/L。Mashimo等[18]將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)成功地應(yīng)用于健康人肺組織總RNA中miRNA的檢測。Zhou等[19]設(shè)計了一種啞鈴狀鎖探針(D-RCA),可顯著提高檢測的特異性和靈敏度,并被應(yīng)用于結(jié)腸腫瘤相關(guān)miRNA的檢測。

2.2.2 指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)

等溫指數(shù)擴(kuò)增是由Jia等[20]首先提出的一種miRNA檢測技術(shù)。其模板包含2個重復(fù)序列,通過一個酶切,觸發(fā)擴(kuò)增反應(yīng),在30 min就可檢測到10 amol/L的miRNA。在此基礎(chǔ)上,科學(xué)家們對上述方法進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化和改善。比如:結(jié)合兩步EXPAR和單量子點(diǎn)納米傳感器技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對let-7家族中l(wèi)et-7a的微量檢測,且其檢測限達(dá)到了0.1 amol/L[21,22]。此外,Liu等[23]設(shè)計了靶向等溫指數(shù)擴(kuò)增(target-assisted isothermal exponential amplification,TAIEA),實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞裂解物中miRNA的快速檢測。Wang等[24]構(gòu)建發(fā)卡式結(jié)構(gòu)模板,將miRNA檢測的靈敏度提高到3.80×10-13mol/L。

等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)在miRNA檢測中具有以下優(yōu)勢:1)檢測范圍廣,可跨越10個數(shù)量級,且最低檢測限可達(dá)到0.1 zmol的水平；2)特異性高,其能對僅相差單個堿基的miRNA進(jìn)行很好的區(qū)分；3)對儀器的要求比較簡單,僅通過水浴就可以實(shí)現(xiàn)；4)反應(yīng)時間較短,可在一個小時內(nèi)完成。因此,EXPAR技術(shù)發(fā)展迅速,成為一種新的檢測miRNA的策略。

3 基于測序的檢測技術(shù)

基于雜交和擴(kuò)增的技術(shù)方法具有一系列優(yōu)點(diǎn),比如:靈敏度高、特異性好等,但是被測定的miRNA序列均要求是已知的,對自然界中很多未知的、有待被開發(fā)的miRNA并不能進(jìn)行定量檢測?；跍y序的檢測技術(shù)可以適用于任何miRNA的檢測和研究,包括未被發(fā)現(xiàn)的序列和已知的序列。

3.1 擴(kuò)增克隆測序法

2006年Takada等[25]提出了miRNA擴(kuò)增克隆法(miRNA amplification profiling,mRAP)。該方法的進(jìn)程總共分為兩個步驟:1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在miRNA的3′端毗連一個接頭,將與接頭互補(bǔ)的短RNA序列作為引物,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；2)常規(guī)PCR反應(yīng)。在整個反應(yīng)體系中加入一對共用引物,實(shí)現(xiàn)常規(guī)的PCR反應(yīng)。mRAP高度靈敏,可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測組織中微量miRNA的表達(dá)量。但該克隆測序法每次只能檢測5個不同的miRNA,不能實(shí)現(xiàn)高通量檢測,檢測效率偏低。Cummins等[26]提出了miRAGE(miRNA serial analysis of gene expression)克隆測序法,其通過單個測序反應(yīng)即可檢測35個不同miRNA,檢測效率明顯提高。

3.2 新一代大規(guī)模測序技術(shù)

新一代大規(guī)模測序技術(shù)能在一次測序過程中對幾百萬個樣本進(jìn)行同時測序,極大提高了測序效率,為更好地發(fā)現(xiàn)和定量miRNA提供了一種有力的工具[27]。其中454測序以及Solexa基因組測序是該測序技術(shù)平臺的兩大代表。454測序是將珠子與兩端連接有接頭的miRNA結(jié)合在一起,然后在油滴(含有PCR反應(yīng)體系)中對其進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增[28]。Solexa基因組測序是將芯片表面帶有的單鏈引物與兩端連接有接頭的miRNA結(jié)合,應(yīng)用邊擴(kuò)增邊測序的原理,對其進(jìn)行序列測定[29]。這兩種測序技術(shù)不用考慮miRNA序列短和同一個家族高度相似性的問題,降低了探針設(shè)計難度[30]。它們能夠?qū)iRNA的表達(dá)進(jìn)行有效定量,檢測靈敏度可達(dá)100 ng[31]；同時,通過生物信息學(xué)的方法,這些技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對未知miRNA的分析[32]。

4 總結(jié)與展望

miRNA由于在疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,因而成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。相關(guān)研究報道,當(dāng)miR-195含量過度表達(dá)時,會導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病和心機(jī)梗死等疾病的發(fā)生。這一現(xiàn)象提示我們可通過對miRNA進(jìn)行定量檢測來實(shí)現(xiàn)對疾病的早期診斷。但是由于成熟miRNA具有片段小、難富集、豐度低等特點(diǎn),人們在對其進(jìn)行定量檢測時往往會遇到不少難題。針對上述問題,現(xiàn)已研究出多種miRNA檢測方法,但是每一種方法都存在著不可規(guī)避的缺點(diǎn),且技術(shù)上有待完善。比如:基于擴(kuò)增原理的PCR技術(shù),其并不能對miRNA進(jìn)行精確測定,但因技術(shù)相對成熟且成本較低,在臨床實(shí)驗(yàn)室中相對被廣泛使用；基于測序原理的大規(guī)模測序技術(shù)雖然能夠快速且高靈敏度地檢測miRNA,但其對數(shù)據(jù)庫較大和復(fù)雜的樣本進(jìn)行測序時,需耗費(fèi)較高的成本。因此,開發(fā)通量更高、靈敏度更高、檢測范圍更廣、檢測時間短的檢測方法仍是相關(guān)科研工作者的一個艱巨任務(wù)和挑戰(zhàn)。