張新國,郭廣君,李 坤,孫巧云,郭思佳,馬小弟,馬國艷

(蘭州理工大學生命科學與工程學院甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室,中國甘肅蘭州730050)

失眠是一種常見病。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的日益加快和競爭壓力的激增,失眠癥的發(fā)生率正逐年增加,并嚴重影響人類身體健康和社會活動能力[1]。源自美國的調查研究發(fā)現(xiàn),33%的人患有失眠[2]。在歐洲,4%～22%的人受到失眠的嚴重影響[3]。國內的研究資料顯示,中國家庭目前失眠癥的發(fā)病率也高達10%～20%[4,5]。因此,進行有效、安全的抗失眠藥物的研究,已成為當前生物制藥領域非常迫切的任務和重要研究方向。

目前,臨床常用具有鎮(zhèn)靜催眠作用的化學合成藥物治療失眠。其中,使用較多的是第二代苯二氮卓類和第三代非苯二氮卓類催眠藥物。這些藥物都不同程度地存在頭暈、頭痛、困倦、乏力、呼吸抑制、肝功能損傷等不良反應,甚至較嚴重的耐藥性和依賴性,并伴發(fā)反跳失眠現(xiàn)象,亟待更換[6]。

現(xiàn)階段,國內外有關新一代催眠藥物的研究主要集中在第四代內源性催眠物質[7,8]。δ-睡眠肽(delta sleep inducing peptide,DSIP)于1977年被美國學者Monnier等[9]發(fā)現(xiàn),經(jīng)鑒定是一個相對分子質量為848.98的九肽,氨基酸序列為Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu。由于其主要的生理活性是促進兔的δ波睡眠,因此被稱為δ-睡眠肽[10]。自從DSIP被發(fā)現(xiàn)以來,關于它的研究從未停止。早在1979年,就有學者報道了δ-睡眠肽及其類似物的合成工作[11]。1981年,Schneider-Helmert等[12,13]將合成的δ-睡眠肽應用于臨床,試驗結果表明其可延長患者睡眠持續(xù)時間和深度,減少夢境,而且對人體無副作用。隨后,也有研究報道了利用生物工程技術對δ-睡眠肽進行的改進性研究[14],但是現(xiàn)有的這些研究仍然無法解決δ-睡眠肽存在的半衰期短、生物利用度低等缺點,臨床應用仍然遙遙無期[15]。

基于此,本研究設計并構建了一種新的融合蛋白PHLD(PTD-HSA-linker-DSIP),它由蛋白質轉導結構域(protein transduction domain,PTD)、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、連接肽(linker)、DSIP融合而成,采用畢赤酵母進行發(fā)酵生產(chǎn)。此融合蛋白既具有DSIP誘導睡眠的活性,又具有HSA半衰期長的特性,并且加入的傳導肽可以較好地通過血腦屏障,不會引起體內的免疫反應和過敏之類的副作用。本研究有望為睡眠肽的應用提供新的思路和方法,所得融合蛋白PHLD將會是一種安全有效的新型催眠候選藥物。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

大腸桿菌 DH5α、pPIC9K和 pPIC9K/HSA質粒、GS115菌株均為本實驗室保存。

1.2 工具酶和試劑

Pfu DNA 聚合酶、Tag DNA 聚合酶、4×dNTP、T4 DNA 連接酶、RNA 酶、EcoR I、Not I、Xho I、HindⅢ、Sal I等均購自MBI Fermentas(加拿大)。Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。pUCm-T載體、牛血清白蛋白以及其他試劑如瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。PCR引物合成及序列測定均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 1.0%,pH 7.0。

YPD培養(yǎng)基:酵母浸出粉1.0%,胰蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%。

MD培養(yǎng)基:YNB 1.34%,生物素4×10-5%,葡萄糖2.0%,瓊脂1.2%。

基礎鹽BSM培養(yǎng)基:甘油4%,H3PO4(85%)2.67%,CaSO4·2H2O 0.093%,K2SO41.82%,Mg－SO4·7H2O 1.42%,KOH 0.413%,濃氨水調節(jié)至所需pH值。

①建立烏梁素海水環(huán)境監(jiān)管領導責任制，各旗縣區(qū)主要領導負總責，監(jiān)管任務層層分解，做到責任清晰、范圍明確、獎懲分明、落實到位。

1.4 pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重組質粒的構建

根據(jù)基因克隆和剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(splicing overlapping extension PCR,SOE-PCR)原理,以pPIC9K/HSA質粒為模板,分別設計上下游引物,上游為含有PTD序列的引物5′-GAATTCTACGGTCGTAAGAAAAGAAGACAACGTAGACTGATGCACACAAGAGTGAG-3′,簡稱為 P 上；下游為含有l(wèi)inker和DSIP序列的引物5′-GCGGCCGCTTATTCTCCAGAAGCATCACCACCAGCCCAAGAACCTCCACCAGACCTCCACCAGAACCTCCACCTAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′,簡稱為D下。利用引物進行PCR擴增就可以得到重組基因片段PTD-HSA-linker-DSIP,簡稱PHLD。瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收后,將重組基因片段PHLD與克隆載體pUCm-T連接,擴增后進行酶切。將酶切產(chǎn)物PHLD片段與pPIC9K連接,即可獲得pPIC9K/PHLD重組質粒。

1.5 pPIC9K/PHLD畢赤酵母工程菌的構建及高表達工程菌株的篩選

將構建所得的pPIC9K/PHLD單菌落用含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基于37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜,隨后用DNA質粒提取試劑盒提取pPIC9K/PHLD質粒,所得的pPIC9K/PHLD重組質粒用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。將pPIC9K/PHLD重組質粒用Sal I酶進行線性化處理,即37℃酶切5 h,酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定回收。然后將上述pPIC9K/PHLD重組質粒電轉化導入至畢赤酵母GS115,接種MD平板后30℃培養(yǎng)3～6 d。將獲得的his+轉化子分別點種于質量濃度為0 mg/mL、0.25 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL 的G418平板,30℃培養(yǎng)3～6 d。挑選單菌落接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中,30℃、250 r/min培養(yǎng)24 h；取菌液接種至基礎鹽BSM培養(yǎng)基中,30℃、250 r/min培養(yǎng),每隔24 h向基礎鹽BSM培養(yǎng)基中添加甲醇。5 d后取菌液離心獲取上清,-20℃凍存用于SDS-PAGE 分析[16]。

1.6 高表達工程菌株最佳誘導時間的確定

從YPD固體培養(yǎng)基上挑取篩選所得的高表達工程菌株,命名為lut1211菌株。將其單菌落接種于50 mL液體YPD培養(yǎng)基中,30℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。隨后,按照10%的接種量接入基礎鹽BSM培養(yǎng)基中,30℃、250 r/min培養(yǎng),每隔6 h收集菌液測定其OD600值,以繪制其生長曲線,并確定最佳的甲醇誘導時間。

1.7 高表達工程菌株發(fā)酵周期及表達譜的測定

取lut1211菌株進行發(fā)酵培養(yǎng),至甘油耗盡時加甲醇進行誘導表達。甲醇的添加量為每24 h向基礎鹽BSM培養(yǎng)基中添加至終濃度為1%,連續(xù)誘導8 d,每天取樣并將樣品離心取上清,用SDS-PAGE及考馬斯亮藍法進行分析[14],繪制融合蛋白表達曲線及蛋白質表達譜。

1.8 PHLD融合蛋白的分離純化

PHLD融合蛋白的分離純化采用文獻報道的方法[16],簡述如下:含有目的蛋白的發(fā)酵樣品加樣到DEAE-cellulose離子交換層析柱,用緩沖液A(0～0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L PBS,pH 7.0)進行線性梯度洗脫,收集目的峰。隨后上樣到Phenyl Sepharose HP Fast Flow疏水層析柱,用緩沖液B(1.0～0 mol/L 硫酸氨,20 mmol/L PBS,pH 7.0)進行線性梯度洗脫,收集目的蛋白。然后上樣到Blue Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱,用緩沖液C(0～2 mol/L NaCl,10 mmol/L PBS,pH 6.0)進行線性梯度洗脫,收集目的峰。最后用Sephadex G-25凝膠色譜進行脫鹽處理,冷凍干燥后即可用于進一步的分析。

2 結果

2.1 成功構建pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重組質粒

pPIC9K/PTD-HSA-linker-DSIP重組質粒的構建原理如圖1A所示。本研究通過SOE-PCR方法成功獲得PHLD基因片段,并將含有EcoR I和Not I位點的目標DNA序列亞克隆到pPIC9K/PHLD表達載體中(圖1A),得到構建體pPIC9K/PHLD。進一步對陽性克隆測序,驗證PHLD基因片段是否成功插入pPIC9K載體。其中PHLD基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后的結果如圖1B所示。對于PTD、HSA、DSIP以及連接肽的融合蛋白,其編碼基因大小為1 868 bp。由電泳圖可知實驗結果與理論設計一致。陽性克隆的測序結果見圖2,將測序結果(sequence 1)與理論設計序列(sequence 2)進行比對,結果顯示PHLD基因已經(jīng)成功插入pPIC9K載體中。

圖1 pPIC9K/PHLD重組質粒的構建(A)pPIC9K/PHLD重組質粒構建的原理圖；(B)PHLD重組基因瓊脂糖凝膠電泳圖。M:DNA marker；泳道1:PHLD基因。Fig.1 Construction of pPIC9K/PHLD recombinant plasmid(A)Schematic diagram for construction of the plasmid pPIC9K/PHLD；(B)Analysis of PHLD gene by agarose gel electrophoresis.Lane M:DNA marker；Lane 1:PHLD gene.

圖2 PHLD基因測序比對結果Fig.2 Sequencing alignment results of PHLD gene

2.2 pPIC9K/PHLD畢赤酵母高表達工程菌株的篩選結果

經(jīng)MD平板和G418抗性平板篩選后,從最終得到的陽性克隆中挑取菌落形態(tài)大且飽滿的菌株進行搖瓶培養(yǎng)并誘導表達,離心收集發(fā)酵上清,SDS-PAGE凝膠電泳進行鑒定,凝膠脫色后用Bio-Rad凝膠照相系統(tǒng)進行拍照分析。結果顯示,編號為lut1211的菌株成功表達PHLD重組蛋白且表達量最高,因此將其作為目標菌株進行進一步的研究。

2.3 高表達工程菌株最佳誘導時間的確定

高表達工程菌株lut1211的生長曲線如圖3所示。從實驗結果中可以看出目的菌株在48 h時達到OD600最大值,表明此時菌體生長停止,甘油耗盡。畢赤酵母甲醇誘導表達中,如果發(fā)酵液中含有甘油,將對目的蛋白的表達發(fā)生抑制,因此本研究將48 h作為甲醇誘導的起始時間。

圖3 高表達工程菌株lut1211的生長曲線圖Fig.3 Growth curve of high expression engineering strain lut1211

2.4 高表達工程菌株發(fā)酵周期及表達譜的測定結果

PHLD融合蛋白在目的菌株中的表達曲線及蛋白質表達譜如圖4所示。由圖片結果可知,隨著誘導時間的延長,重組蛋白的表達量逐漸增加,蛋白質譜帶的顏色也隨之加深,目的蛋白的表達量在第5天時達到最大,因此可以確定最佳的發(fā)酵周期(放瓶時間)為5 d。此外,由圖4B可知,重組蛋白的相對分子質量與牛血清白蛋白的大小相近,與理論一致,說明得到的重組蛋白正確。

2.5 融合蛋白的初步分離純化

PHLD融合蛋白通過層析柱分離及G-25凝膠脫色脫鹽后,采用SDS-PAGE進行分析,結果如圖5所示。由圖5可知,經(jīng)多步層析分離純化后可得到電泳純樣品,所得蛋白質純度較高,能滿足對其進一步評價的需要。

3 討論

圖5 PHLD融合蛋白初步分離純化電泳圖泳道1:純化后的凍干樣品；泳道2:DEAE-cellulose離子交換層析樣品；泳道3:藍色葡聚糖親和層析樣品；泳道4:疏水層析樣品；泳道5:待分離樣品；M:蛋白質marker。Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified PHLD fusion proteinLane 1:Lyophilized PHLD fusion protein；Lane 2:PHLD fusion protein purified by DEAE-cellulose-52 chromatography；Lane 3:Recombinant PHLD purified by Blue Sepharose 6 Fast Flow chromatography；Lane 4:PHLD fusion protein purified by Phenyl Sepharose HP Fast Flow chromatography；Lane 5:Culture supernatant；M:Protein marker.

δ-睡眠肽(DSIP)自從問世以來,關于它的研究就從未停止。雖然它在動物體內的含量極微,但是療效確切,活性較強。在過去的10年中,DSIP主要從化學和酶合成途徑獲得[17,18],盡管人工合成δ-睡眠肽的技術已經(jīng)很成熟,但是作為一種相對分子質量較低的九肽,其在體內的半衰期很短,因此人工合成的δ-睡眠肽并不能從根本上解決它在臨床上的實際應用問題[16]。基于此,研究人員嘗試采用谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione-S-transferase,GST)構建的GST-DSIP融合蛋白在大腸桿菌中表達生產(chǎn)DSIP,但GST-DSIP融合蛋白在動物中的注射可引起與GST酶活性相關的生化反應[14,19]。此外,盡管重組蛋白GST-DSIP用GST親和柱容易純化,但是要從GST-DSIP獲得完整的DSIP,需要進行復雜的處理,如利用凝血酶切割和CNBr反應從融合蛋白中切割獲得靶肽[20]、去除切割的副產(chǎn)物等[21]。因此,利用基因工程技術通過融合蛋白進行DSIP的表達,仍然存在諸多的問題。

人血清白蛋白(HSA)是由585個氨基酸殘基組成的心形結構蛋白質,包含17對二硫鍵和1個游離的半胱氨酸,有3個α-螺旋同源區(qū)域,每1個區(qū)域有10個螺旋,分為反平行的六螺旋亞區(qū)域和四螺旋亞區(qū)域。作為血漿中含量最豐富的蛋白質,HSA在正常人體內起著非常重要的生理作用。HSA不僅具有較大的相對分子質量,正常情況下不易透過腎小球,而且體內分布極廣,具有無免疫原性、人體相容性好、組織分布廣、無酶活等特性,通常被用做理想的藥物融合載體[22～24]。例如,人們將人α-干擾素、生長因子以及神經(jīng)生長因子與HSA進行了融合表達,所獲得的產(chǎn)物目前都進入了臨床前研究[25～27]。因此,本研究中睡眠肽與HSA融合表達所得目的產(chǎn)物無需酶切。此外,與人血漿中半衰期為7～8 min的游離DSIP相比,融合蛋白的血清穩(wěn)定性和相對分子質量的增加將有望改善并延長體內DSIP的壽命[28]。

人類免疫缺陷病毒HIV-1的轉錄激活因子能夠有效引導蛋白質穿透細胞膜,并保持蛋白質的生物活性[29,30]。其分子中具有蛋白質轉導作用的基本結構是一個富含堿性氨基酸的多肽片段,被稱為蛋白質轉導結構域(protein transduction domain,PTD)[31,32]。PTD的核心序列是YGRKKRRQRRR,能夠有效引導肽段或者蛋白質進入細胞,具有蛋白質傳送的功能。PTD與其他蛋白質融合后不僅可快速、高效地進入細胞,而且不會影響原有蛋白質的生物學功能[33]。此外,PTD還具有攜帶大分子通過細胞膜和血腦屏障的功能[34～36]。因此,本研究利用PTD這種能攜帶融合蛋白自由進入細胞的獨特功能,設計構建了PHLD融合蛋白,該融合蛋白能夠更好地透過血腦屏障,進而起到改善睡眠的作用。

本項目組在前期的研究中,構建表達了PTD-HSA-DSIP融合蛋白,顯示了較好的改善睡眠的作用[16]。連接肽是融合蛋白構建中不可或缺的組成部分。在設計融合蛋白時,接入連接肽會引起小分子蛋白質漂離大分子蛋白質,從而盡可能地降低可能存在的空間位阻對活性的影響。目前,含有Gly-Ser的連接肽是相關研究中應用較多的連接肽之一。尤其是其中的(Gly4Ser)3序列,因其具有較合適的氨基酸長度,同時具有疏水性和伸展性,并能使功能蛋白質具有較好的穩(wěn)定性與生物活性,已經(jīng)成為了“通用連接肽”并被廣泛用于融合蛋白的構建[37]。因此,本研究中設計構建含有連接肽的融合蛋白,以更好地改善融合蛋白的生物活性。

本研究通過PCR擴增技術獲得PHLD基因片段,成功構建了分泌型表達PHLD融合蛋白的質粒pPIC9K/PHLD,獲得了高表達的pPIC9K/PHLD畢赤酵母工程菌,并對其發(fā)酵生產(chǎn)PHLD融合蛋白的條件進行了考察,初步確定了目的融合蛋白生長及制備的最佳條件,而且獲得了較高純度的融合蛋白,這為進一步研究DSIP奠定了基礎。