許 飛,金 磊,聶志妍,陳林軍,鄭 紅*

(上海健康醫(yī)學(xué)院a.微生物與免疫教研室；b.檢驗(yàn)與檢疫系,中國(guó)上海201318)

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)領(lǐng)域突破性的發(fā)現(xiàn)為探索人類疾病的機(jī)制和治療提供了新的視角。1976年,研究者在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發(fā)現(xiàn),類病毒(viroid)能侵染植株并導(dǎo)致死亡。與病毒不同的是,類病毒沒有蛋白質(zhì)外殼包被,基因組是單鏈、閉合的RNA分子[1]。1979年,洛克菲勒大學(xué)的Hsu和Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到,真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有環(huán)狀RNA的存在[2]。這類RNA缺乏5′帽結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾,單鏈呈環(huán)形,因此被稱為環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)。起初,circRNA被認(rèn)為是RNA剪接過程中的無用產(chǎn)物。隨著高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,人們才逐漸揭示circRNA 的真正“面目”[3]。

在正常的轉(zhuǎn)錄環(huán)境中,外顯子剪接使得前體RNA轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓男攀筊NA(messenger RNA,mR-NA),但是對(duì)于環(huán)狀RNA而言,外顯子的不規(guī)則拼接導(dǎo)致了環(huán)狀RNA的形成[4～6]。例如,性別決定基因SRY(sex region of Y chromosome)在正常情況下轉(zhuǎn)錄翻譯成SRY蛋白。但是,RNA不規(guī)則拼接使得外顯子轉(zhuǎn)錄的前體RNA成環(huán),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯受阻[7]。circRNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其免受核酸外切酶的水解,與其他線性RNA相比結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。circRNA的主要功能之一是作為miRNA“分子海綿”,吸附miRNA,從而抑制miRNA的活性[8]。因此,circRNA在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后修飾過程中起著重要的“微調(diào)(fine-tuning)”作用。越來越多的研究顯示,circRNA在腫瘤、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等人類疾病過程中都發(fā)揮著重要作用[3,9,10]。隨著高通量測(cè)序、芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用,circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能受到越來越多的關(guān)注。circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中高度富集,其表達(dá)的高度保守性、特異性和穩(wěn)定性,為circRNA作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病診治的標(biāo)志物提供了巨大的潛力。這里,我們首先對(duì)circRNA的產(chǎn)生機(jī)制以及生物學(xué)功能做簡(jiǎn)單概述,然后著重介紹circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展。

1 circRNA的產(chǎn)生機(jī)制及檢測(cè)方法

目前,有關(guān)circRNA的產(chǎn)生機(jī)制主要有3種模型假說:套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(lariat-driven circularization)、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(intron-pairingdriven circularization)以及RBP配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(RBP-pairing-driven circularization)[11,12]。第 1 種模型認(rèn)為前體RNA的轉(zhuǎn)錄過程中由于RNA發(fā)生了部分折疊,拉近了原本非相鄰的外顯子,從而發(fā)生了外顯子跳躍(exon skipping),使得被跨越的區(qū)域形成了環(huán)形RNA中間體,中間體則進(jìn)一步通過套索剪接形成由外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子,即外顯子circRNA(圖1)[11]。在內(nèi)含子拼接位點(diǎn)的短重復(fù)序列,例如 Alu序列,可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)促進(jìn)外顯子環(huán)化[13～15]。Aktas等[16]發(fā)現(xiàn) RNA 解旋酶DHX9特異性結(jié)合反向Alu元件調(diào)控RNA加工和circRNA形成,DHX9缺失會(huì)導(dǎo)致環(huán)狀RNA增多,這為反向Alu元件調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工過程提供了全新的機(jī)制模型。

圖1 套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化[11]Fig.1 Lariat-driven circularization[11]

第2種模型認(rèn)為,位于內(nèi)含子區(qū)域的反向互補(bǔ)序列介導(dǎo)內(nèi)含子區(qū)域配對(duì),從而形成內(nèi)含子circRNA(圖2)[12]。近期有報(bào)道稱,發(fā)現(xiàn)了環(huán)化的外顯子中間保留內(nèi)含子序列的circRNA,即外顯子—內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exon-intron circRNA,EIci-RNA),但其發(fā)生機(jī)制尚不明確[17]。一項(xiàng)研究表明,內(nèi)含子拼接位點(diǎn)中的反向互補(bǔ)重復(fù)序列(reverse complementary repeat,RCR)會(huì)增強(qiáng)環(huán)化效率[18]。在進(jìn)化的過程中,RCR序列的產(chǎn)生源于堿基序列的隨機(jī)重復(fù)。一種RNA編輯酶——腺苷脫氨酶1(adenosine deaminase that acts on RNA,ADAR1),可抑制RCR的作用,敲除ADAR1可顯著增強(qiáng)circRNA 的表達(dá)[14]。

圖2 內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化[12]Fig.2 Intron-pairing-driven circularization[12]

第3種模型是依賴RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,RBP)的環(huán)化(圖 3)[19]。RBP 結(jié)合在序列的兩端,促進(jìn)兩端靠近、成環(huán),再將環(huán)中的內(nèi)含子序列去除,僅保留外顯子序列。例如,甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin,MBL)可以作為RNA結(jié)合蛋白促進(jìn)circMBL的生物合成[9]。此外,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)RBP也可能抑制circRNA的形成,例如前文陳述的ADAR1蛋白[14]。

圖3 RBP配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化[19]Fig.3 RBP-pairing-driven circularization[19]

上述3種模型并非平等存在,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化往往較常發(fā)生[5]。雖然以上3種模型都已被證實(shí),但是circRNA的精確形成機(jī)制尚未明了。circRNA的表達(dá)調(diào)控以及是否還有其他合成方式等問題仍需更加深入的研究。

circRNA沒有5′端帽結(jié)構(gòu)和 3′端 poly(A)尾,因此能抵抗核酸外切酶的水解。與其他RNA相比,circRNA更加穩(wěn)定,半衰期大約是mRNA的5倍[15]。但是,正是由于5′端帽結(jié)構(gòu)和3′端poly(A)尾結(jié)構(gòu)的存在,mRNA能夠從細(xì)胞核出來進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì),而缺乏這些結(jié)構(gòu)的circRNA又是通過什么方式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的呢？關(guān)于circRNA的出核機(jī)制有一些不同的理論,其中有人推測(cè)circRNA是在細(xì)胞分裂的時(shí)候進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的,但是在非分裂的神經(jīng)元中circRNA也可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),推翻了這一猜測(cè)。因此,circRNA的出核機(jī)制還有待深入研究。

目前常用的circRNA分離方法有以下幾種。第1種是利用RNase R酶水解線性RNA。用RNase R處理總RNA,即可分離出circRNA[20]。第2種是利用凝膠電泳阻滯來分離circRNA。將總RNA與融化的凝膠混勻,在凝固的過程中,只有circRNA可以與凝膠交聯(lián)。凝膠凝固后,在電場(chǎng)的作用下,線性RNA遷移,一定時(shí)間后線性RNA全部遷移出凝膠,這樣就可將凝膠中交聯(lián)的circ-RNA分離出來[21,22]。另外,還可以利用含有poly(T)基質(zhì)的親和層析方法,將含有poly(A)尾的線性mRNA與沒有poly(A)尾的circRNA分離[23]。

穩(wěn)定表達(dá)的外顯子circRNA可以通過高通量測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。circRNA可以用發(fā)散性引物(divergent primer)來擴(kuò)增(圖4)[24]。發(fā)散性引物不能擴(kuò)增引物之間的區(qū)域,而是從引物所在位點(diǎn)向序列兩端擴(kuò)增。因此,應(yīng)用此引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),線性RNA是沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的,只有環(huán)形circRNA有大小一定的目的產(chǎn)物[24]。

圖4 擴(kuò)增circRNA的發(fā)散性引物[24]Fig.4 Divergent primers used for quantitation of circ-RNA[24]

此外,一些在線數(shù)據(jù)庫(kù)可用于circRNA的信息查詢。Glazar等[25]發(fā)表了circBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.circbase.org/),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)整合了目前已經(jīng)報(bào)道的所有circRNA。Ghosal等[26]開發(fā)了Circ2Trait在線工具(http://gyanxetbeta.com/circdb/),可以預(yù)測(cè)circRNA與miRNA、circRNA與蛋白質(zhì)等的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最近,Dudekula等[27]公布了CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://circinteractome.nia.nih.gov/),該數(shù)據(jù)庫(kù)可預(yù)測(cè)miRNA和circRNA的相互作用。

2 circRNA的生物學(xué)功能

2.1 circRNA作為miRNA“分子海綿”

外顯子circRNA的主要功能是作為特定mi-RNA的“分子海綿”,抑制miRNA的活性,從而增強(qiáng)miRNA下游靶基因的表達(dá)[28,29]。這類circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。例如,ciRS-7含有超過70個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn),可作為miR-7的“分子海綿”吸附miR-7,從而抑制miR-7的活性[8]。ciRS-7能夠調(diào)節(jié)翻譯小腦變性相關(guān)蛋白1(cerebellar degeneration-related protein 1,CDR1)的轉(zhuǎn)錄物,故又稱之為CDR1as(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript)。ciRS-7/CDR1as與miR-7的結(jié)合使miR-7的靶基因表達(dá)得以增加[8,30]。在斑馬魚胚胎中過表達(dá)CDR1as會(huì)導(dǎo)致中腦縮小,與miR-7缺失所引起的表型類似[30]。與SRY基因共表達(dá)的circRNA Sry有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn),可使miR-138的表達(dá)降低[30]。另一項(xiàng)研究顯示,ZNF基因的circRNA ZNF91有24個(gè)miR-23結(jié)合位點(diǎn)和7個(gè)miR-199結(jié)合位點(diǎn)[31]。此外,cir-ITCH的序列跨越E3泛素連接酶的外顯子序列,可作為miR-7、miR-17和miR-214的“分子海綿”[32]。

2.2 circRNA與蛋白質(zhì)相互結(jié)合

circRNA不僅能與RNA結(jié)合,也能與蛋白質(zhì)(主要是RBP)結(jié)合。有研究報(bào)道circRNA能夠與AGO蛋白(Argonaute)以及RNA聚合酶Ⅱ相互結(jié)合[15,30]。MBL基因表達(dá)的MBL蛋白可以作為RBP結(jié)合在MBL的前體RNA上,促使其環(huán)化形成circMBL,抑制RNA的翻譯。而且circMBL又能與MBL蛋白結(jié)合,抑制MBL蛋白的活性[9,33]。一些circRNA(如 ci-ankrd52、ci-mcm5 和 ci-sirt7)參與RNA聚合酶Ⅱ的延伸機(jī)制,順式調(diào)節(jié)宿主基因的轉(zhuǎn)錄活性[34]。例如,ci-ankrd52可以在宿主基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)積累,并參與RNA聚合酶Ⅱ的延伸,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[34]。一些EIciRNA(例如circ-EIF3J和circPAIP2)可以與U1 snRNA相互作用促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[35]。此外,circRNA還可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。研究報(bào)道,CDR1as能通過穩(wěn)定CDR1的mRNA促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)[21]。circRasGEF1B可通過穩(wěn)定ICAM-1的mRNA,正向調(diào)節(jié)ICAM-1基因的表達(dá)[36]。

2.3 circRNA的翻譯功能

事實(shí)上,絕大多數(shù)的circRNA來源于編碼蛋白質(zhì)的基因序列,而且定位于細(xì)胞質(zhì)中。那么這些circRNA是否能夠有翻譯的功能呢？Wang等[37]通過基因編輯的方法證實(shí),含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)的circRNA能夠翻譯產(chǎn)生多肽。最近一項(xiàng)研究則顯示,沒有IRES或者經(jīng)典翻譯結(jié)構(gòu)(5′帽結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾結(jié)構(gòu))的circRNA也存在翻譯功能[38]。有研究報(bào)道,一些外顯子circRNA含有起始密碼子[39]。但是相關(guān)研究顯示,circRNA的起始密碼子很可能是抑制線性mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯,其本身并不能編碼蛋白質(zhì),即“mRNA 陷阱(mRNA trap)”[40]。最近,Yang等[28]首次報(bào)道了circRNA存在N6-甲基腺苷化修飾(N6-methyladenosine,6mA or m6A),并且該修飾能促進(jìn)circRNA的翻譯。緊接著,Sebastian Kadener的研究團(tuán)隊(duì)利用果蠅模型通過核糖體印跡分析(ribosome footprinting)發(fā)現(xiàn)了大量具有翻譯功能的circRNA[41]。而Irene Bozzoni團(tuán)隊(duì)則通過臨床樣本和小鼠模型證實(shí)circ-ZNF609可直接翻譯蛋白質(zhì),并且該蛋白質(zhì)與肌肉發(fā)生過程有關(guān)[42]。這些研究結(jié)果為環(huán)狀RNA的功能研究提供了非常有價(jià)值的思路。

3 circRNA參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的調(diào)控

人體各個(gè)組織的深度測(cè)序結(jié)果顯示,腦的circRNA含量最高[43]。而且在神經(jīng)發(fā)育過程中,circ-RNA在大腦的各個(gè)部位均有較高的表達(dá)[44,45]。circ-RNA在神經(jīng)形成、神經(jīng)發(fā)育以及突觸可塑性過程中的高表達(dá),暗示了circRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用[46]。表1總結(jié)了與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的circRNA。

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是由大腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元退行性病變引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病?；蛩健⑸窠?jīng)病理學(xué)水平、細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí),α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是PD發(fā)病機(jī)制過程的關(guān)鍵分子[47,48]。α-Syn的過度積累會(huì)引起多巴胺能神經(jīng)元的功能損傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-7能降低α-Syn的mRNA水平[48]。而且,敲減CDR1as可增加miR-7的活性,抑制miR-7靶基因的表達(dá)。因此,CDR1as和miR-7很可能在PD發(fā)病機(jī)制的調(diào)控過程中起著重要的作用[30]。

另一種重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病——阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是由 β-淀粉樣蛋白過度積累造成的。這一過程也與miRNA有關(guān),包括let-7i、miR-451、miR-338、miR-210、miR-181c、miR-146b、miR-15 和 miR-9 等[49～52]。泛素蛋白連接酶A(ubiquitin protein ligase A,UBE2A)是miR-7的一個(gè)靶基因,在β-淀粉樣蛋白的清除過程中起著非常重要的作用。Lukiw等[53]發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,AD患者海馬區(qū)ciRS-7顯著下調(diào),從而導(dǎo)致miR-7水平增加,過量的miR-7可以促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的積累,也可促進(jìn)tau蛋白的高磷酸化,最后導(dǎo)致病變。近期一項(xiàng)研究顯示,miR-138可通過RARA(retinoic acid receptor alpha)/GSK-3β(glycogen synthase kinase-3β)通路促進(jìn) tau的磷酸化,而且AD小鼠模型中miR-138表達(dá)上調(diào)[54]。因此,circRNA Sry和miR-138在AD中的具體調(diào)控機(jī)制也值得我們更深入的研究。

MBL可以促進(jìn)circMBL的生物合成,而circ-MBL又可以作為MBL蛋白的海綿,與MBL相互結(jié)合[33]。人類MBL的直系同源物MBNL蛋白在強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良(myotonic dystrophy,DM)中起著重要作用。當(dāng)DM相關(guān)致病基因表達(dá)時(shí),CUG和CCUG重復(fù)序列會(huì)纏繞形成頸環(huán)結(jié)構(gòu),MBNL蛋白可與這些頸環(huán)結(jié)合從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的錯(cuò)誤剪接,而這些錯(cuò)誤剪接的轉(zhuǎn)錄本翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與DM臨床病理相關(guān)[55,56]。因此,circMBL很可能通過MBL/MBNL蛋白在DM的致病機(jī)理中起著關(guān)鍵的作用。

另外,研究發(fā)現(xiàn)在重性抑郁障礙(major depressive disorder,MDD)患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中某些circRNA的表達(dá)異常[57]。與健康對(duì)照相比,MDD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的hsa_circRNA_103636表達(dá)下調(diào)。但在抗抑郁治療8周后,MDD患者的hsa_circRNA_103636表達(dá)有顯著增加。上述結(jié)果提示,hsa_circRNA_103636很可能是MDD診斷和治療的新靶點(diǎn)[57]。

circRNA不僅僅直接參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控,還可以通過其他途徑影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能[19]。很多研究已證實(shí),circRNA參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括消化系統(tǒng)腫瘤[32,58,59]、乳腺癌[60]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[61]等等。ciRS-7不僅在大腦中表達(dá),在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤中也表達(dá)[62]。在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型以及惡性膠質(zhì)瘤模型中,miR-7能顯著抑制腫瘤的血管生成和腫瘤增殖[63,64]。因此,ciRS-7很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制。Fu等[65]研究發(fā)現(xiàn),miR-138能通過靶基因RUNX3(Runt-related transcription factor 3)調(diào)節(jié) T輔助淋巴細(xì)胞亞群的平衡。而circRNA Sry可抑制miR-138的活性。此外,Has-circRNA 2149只有在CD19陽性的淋巴細(xì)胞中表達(dá),在CD34陽性的淋巴細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞中均不表達(dá)[66]。綜合上述分析可知,circRNA很可能與神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病相關(guān)。

實(shí)際上,circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的精確角色還有待更加深入的探索和研究。circRNA和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系將為疾病的機(jī)制研究和診斷提供新的思路和角度。

4 總結(jié)與展望

非編碼RNA(包括miRNA、lncRNA以及circ-RNA等)的研究發(fā)展迅速,已經(jīng)成為探索人類疾病機(jī)制以及診斷的熱點(diǎn)[67]。非編碼RNA就像是分子促發(fā)器,可以促發(fā)多種相關(guān)因素的發(fā)生。而circ-RNA獨(dú)一無二的環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)使其成為非常獨(dú)特的分子標(biāo)記物,很容易與其他細(xì)胞內(nèi)的分子相區(qū)分。circRNA為疾病的靶向治療提供了全新的視角。circRNA作為疾病診斷工具,具有以下幾個(gè)特點(diǎn)[15,43,45,67～71]:1)序列的保守性；2)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；3)表達(dá)的普遍性；4)組織的特異性。作為比較前沿的研究領(lǐng)域,circRNA的結(jié)構(gòu)和功能仍然有很多有趣的問題值得研究,比如:影響circRNA表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制；在不同生理和病理?xiàng)l件下circRNA的功能；在神經(jīng)組織中circRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)性和亞細(xì)胞定位的生物學(xué)功能等等。

circRNA獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能使其成為探究疾病機(jī)制、診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。尤其是針對(duì)多種特定circRNA組成的特異指紋圖譜的研究,可以為早期診斷提供更為完善的標(biāo)記。circRNA的miRNA“分子海綿”功能也有可能作為基因編輯和基因調(diào)控的新技術(shù)。關(guān)于circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制研究正飛速發(fā)展。隨著生物信息學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的不斷發(fā)展,揭示circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生理學(xué)和病理學(xué)功能,將為我們建立基于circRNA的臨床治療和診斷策略提供有力的支持和幫助。

表1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的circRNATable 1 Summary of circRNAs in human neurological diseases