何富強(qiáng),付軍明,郭君其,朱凌峰

(福建醫(yī)科大學(xué)福州總醫(yī)院泌尿外科,中國福建福州350025)

膀胱的主要生理功能是通過輸尿管將腎臟收集到的尿液進(jìn)行儲存,并通過尿道從體內(nèi)排出。膀胱癌的發(fā)生與膀胱細(xì)胞的異常生長密切相關(guān)。該疾病是一種世界范圍內(nèi)常見的癌癥,在男性和女性惡性腫瘤的死亡率中分別位列第四位和第十位,且表現(xiàn)出比其他惡性腫瘤更高的復(fù)發(fā)率[1]。膀胱癌分為移行細(xì)胞癌(約占病例的90%)、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肉瘤或小細(xì)胞癌(約占病例的10%)等5種類型[2],主要癥狀包括無痛性毛細(xì)血管瘤、血尿、膀胱刺激癥狀、骨盆或骨性疼痛、下肢水腫或側(cè)面疼痛等[3]。目前,膀胱癌發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明,因此選擇多種生物信息學(xué)手段作為本研究的研究方法,旨在闡明淋巴細(xì)胞白血病缺失基因1(deleted in lymphocytic leukemia 1,DLEU1)的功能及其在膀胱癌發(fā)展過程中的重要作用。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc-RNA)是長度超過200個(gè)核苷酸,且不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),參與諸如胚胎發(fā)育[4]、細(xì)胞生長[5]、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6]等各種生理病理過程。lncRNA的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7],已被作為胃癌、肝癌等腫瘤生存和復(fù)發(fā)的生物診斷標(biāo)志物[8,9]。膀胱癌中研究最廣泛的 lncRNA 包括 H19[10]、MALAT1[11]、UCA1[12]、HOTAIR[13]和 MEG3[14]。其中,H19、MALAT1和HOTAIR與膀胱癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)[15]；UCA1與膀胱癌的分級和分期顯著關(guān)聯(lián)。

在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病中,較頻繁的細(xì)胞遺傳學(xué)突變就是染色體13q14的缺失,提示在該基因座處存在可能的抑癌基因[16]。Tyazhelova等[17]通過載體構(gòu)建、數(shù)據(jù)庫搜索和缺失作圖等方式,在13q14上的10 kb區(qū)域內(nèi)克隆出淋巴細(xì)胞白血病缺失基因DLEU1和DLEU2。后續(xù)研究表明,DLEU1參與Burkitt淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[18,19]。DLEU1在膀胱癌中的生物學(xué)功能尚未被研究。在此,我們首次采用GO分析、信號通路富集分析等生物信息學(xué)方法,綜合探討DLEU1的基本生物學(xué)功能,并進(jìn)一步揭示DLEU1在膀胱癌進(jìn)展過程中相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與方法

綜合利用Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology[20](http://atlasgeneticsoncology.org/)、Dcode[21](www.dcode.org)、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、GWAS Catalog[22](www.ebi.ac.uk/gwas/)、Open Target Platform[23](www.targetvalidation.org)、HPA RNA-seq[24]、FireBrowse[25](http://firebrowse.org)、Wanderer[26](http://maplab.imppc.org/wanderer/)、GEPIA[27](http://gepia.cancer-pku.cn/)、Multi Experiment Matrix[28](http://biit.cs.ut.ee/mem)、Linked-Omics[29](http://www.linkedomics.org)和Metascape[30](http://metascape.org)等生物信息學(xué)工具對lncRNA DLEU1的功能及其在膀胱癌中的作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行全面的分析,并得出相應(yīng)的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 人DLEU1基因染色體定位及轉(zhuǎn)錄本分析

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology數(shù)據(jù)顯示,人DLEU1基因定位于13q14.2～q14.3,具體坐標(biāo)為(GRCh38):13:50 082 168～50 528 643,全長 641.89 kb(圖 1)?；蚪M序列分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DLEU1和DLEU2相距約300 bp,以頭對頭的方式排列,并以相反的方向轉(zhuǎn)錄。DLEU1主要可以轉(zhuǎn)錄成3個(gè)轉(zhuǎn)錄本:NR_002605(2個(gè)外顯子)、NR_109973(3個(gè)外顯子)和NR_109974(7個(gè)外顯子)。

2.2 人DLEU1物種保守性分析

在進(jìn)化生物學(xué)中,不同物種間核酸(DNA或RNA)、蛋白質(zhì)中的高度保守序列是經(jīng)自然選擇不斷優(yōu)化篩選幸存下來的,提示該序列在物種進(jìn)化中可能發(fā)揮重要功能。目前,保守序列的鑒定通常采用基于序列比對的生物信息學(xué)方法。圖2為ECR Browser比對結(jié)果,圖中最頂端為DLEU1基因外顯子和內(nèi)含子的基因注釋；下面依次為小鼠、大鼠、狗、牛、恒河猴和黑猩猩DLEU1基因組與人DLEU1基因組的比對圖,每個(gè)峰代表基因組中序列相似性高的高度保守區(qū)域,其中黃色區(qū)域代表基因非編碼區(qū),綠色區(qū)域代表轉(zhuǎn)座子和短重復(fù)序列,橙色區(qū)域代表內(nèi)含子。結(jié)果顯示,與6個(gè)其他脊椎動(dòng)物基因組相比,人DLEU1基因中存在多個(gè)峰值高的區(qū)域,提示這些區(qū)域高度保守,可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

2.3 人DLEU1在多種正常組織中的表達(dá)分析

為了明確DLEU1的功能,首先需要明確DLEU1在不同組織中的表達(dá)情況。利用HPA RNA-seq方法對 95名個(gè)體來源的27種正常組織進(jìn)行測序,分析DLEU1 RNA的表達(dá)變化(項(xiàng)目號:PRJEB4337)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DLEU1廣泛表達(dá)于多種器官中,在睪丸、結(jié)腸、皮膚、腎臟等組織中高表達(dá),同時(shí)在膀胱組織中也有較高表達(dá)(圖3),提示該基因可能在多種器官生理和病理過程中發(fā)揮特定的作用。

圖1 人DLEU1基因染色體定位及轉(zhuǎn)錄本分析Fig.1 Chromosomal location and transcript analysis of human DLEU1 gene

圖2 通過ECR Browser比對人類基因組與6個(gè)其他脊椎動(dòng)物基因組中DLEU1基因的保守性Fig.2 Alignment of the conserved DLEU1 between human and other six vertebrate species by ECR Browser

2.4 DLEU1的生物學(xué)功能

圖3 DLEU1廣泛表達(dá)于人正常組織中Fig.3 DLEU1 is widely expressed in human normal tissues

Targetvalidation主要基于基因組關(guān)聯(lián)分析和文本挖掘分析基因的功能。為了明確DLEU1的基本生物學(xué)功能,我們在Targetvalidation上鍵入DLEU1,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DLEU1與腫瘤(卵巢癌、白血病、急性骨髓性白血病、胃癌、前列腺癌、Burkitt淋巴瘤、乳腺癌等)、多發(fā)性硬化癥乳糜瀉、原發(fā)性膽汁性肝硬化等疾病密切相關(guān),且還參與身高的調(diào)控,涵蓋生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等,具有廣泛的生物學(xué)功能(圖4)。

GWAS Catalog是NHGRI-EBI旗下對已發(fā)表的基因進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究的網(wǎng)站。我們通過該網(wǎng)站進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與Targetvalidation得出的結(jié)果類似,位列前六位的表型包括身高、PSA檢測、主動(dòng)脈根部大小、體重指數(shù)、臀圍、原發(fā)性膽汁性肝硬化(表1)。此外,乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤也位列其中。以上信息提示DLEU1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2.5 DLEU1在多種腫瘤中的表達(dá)

Firebrowse Gene Expression Viewer可對腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)情況的分析。在該網(wǎng)站中鍵入DLEU1,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DLEU1在膀胱癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、胃癌(STAD)、肺癌(LUAD)等絕大多數(shù)腫瘤中均呈高表達(dá)(與正常對照相比)(圖5)。此結(jié)果與DLEU1生物學(xué)功能分析結(jié)果一致,表明DLEU1可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程。

2.6 DLEU1在膀胱癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

Wanderer是主要用于探索人類癌癥中DNA甲基化和基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)分析平臺。具體的分析步驟如下:樣本類型選擇膀胱上皮細(xì)胞癌,數(shù)據(jù)類型選擇Illumina Hiseq RNAseq,Adjust P value threshold選擇P＜0.05。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與19例癌旁正常組織相比,DLEU1在267例膀胱癌患者中顯著性高表達(dá)(P＜0.05,圖6A)。GEPIA是由北京大學(xué)開發(fā)的用于分析TCGA和GTEx項(xiàng)目中9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù),提供腫瘤/正常差異表達(dá)、癌癥類型或病理分期、患者生存分析等結(jié)果。進(jìn)一步的生存分析結(jié)果顯示,DLEU1的高表達(dá)與膀胱癌患者整體生存率和無病生存率的降低顯著相關(guān)(P=1.9E-05；4.4E-05,圖6B),提示DLEU1可能作為癌基因參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

2.7 多種腫瘤芯片中與DLEU1共表達(dá)的基因及其KEGG富集、PPI分析

圖4 通過Targetvalidation預(yù)測與DLEU1基因相關(guān)的疾病Fig.4 The diseases associated with DLEU1 predicted by Targetvalidation

表1 GWAS Catalog全基因組關(guān)聯(lián)分析與DLEU1基因相關(guān)的表型Table 1 Phenotypes associated with DLEU1 by GWAS analysis

圖5 DLEU1在多種TCGA腫瘤中的表達(dá)Fig.5 The expression of DLEU1 in several TCGA tumor samples

為了探究DLEU1在不同腫瘤進(jìn)程中所參與的共同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,我們采用MEM(Multi Experiment Matrix)平臺針對100個(gè)與腫瘤表達(dá)相關(guān)的芯片進(jìn)行DLEU1的共表達(dá)基因分析,得到與DLEU1共表達(dá)的前200個(gè)基因列表(圖7A)。將得到的基因輸入Metascape進(jìn)行GO信號通路富集分析和PPI蛋白質(zhì)互作分析。結(jié)果表明,在眾多腫瘤芯片中,DLEU1可能與細(xì)胞周期、線粒體分裂、DNA復(fù)制、DNA完整性檢查點(diǎn)、微管骨架蛋白組裝、ncRNA代謝等細(xì)胞生物學(xué)功能相關(guān) (圖7B)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步表明,DLEU1可能與細(xì)胞周期等過程密切相關(guān)。具體結(jié)果如圖7C所示,其中MCODE_1代表有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)；MCODE_2代表核糖體生物合成；MCODE_3代表DNA同源重組；MCODE_4代表線粒體轉(zhuǎn)錄；MCODE_5代表snRNA轉(zhuǎn)錄。

2.8 DLEU1在TCGA-BLCA中的共表達(dá)基因及其KEGG富集、PPI分析

圖6 DLEU1的表達(dá)與膀胱癌患者生存預(yù)后的關(guān)系(A)DLEU1在TCGA-BLCA中的表達(dá)分析；(B)DLEU1高表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Fig.6 The expression of DLEU1 and survival analysis in TCGA-BLCA samples(A)Expression analysis of DLEU1 in TCGA-BLCA；(B)High expression of DLEU1 is negatively correlated with prognosis of patients with bladder cancer.

為了探究DLEU1在膀胱癌進(jìn)程中所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,我們采用LinkedOmics對TCGABLCA進(jìn)行DLEU1的共表達(dá)差異分析(圖8A),得到與DLEU1共表達(dá)的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因列表,并將得到的前200名正相關(guān)基因輸入Metascape,進(jìn)行GO信號通路富集分析和PPI蛋白質(zhì)互作分析。結(jié)果表明,在TCGA-BLCA腫瘤樣本中,DLEU1可能與ncRNA代謝途徑、碳代謝、ncRNA轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞生物學(xué)功能正相關(guān)(圖8B)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明,DLEU1可能與ncRNA代謝途徑等相關(guān)過程關(guān)系密切,具體結(jié)果如圖8C所示,其中MCODE_1代表rRNA代謝；MCODE_2代表rRNA修飾；MCODE_3代表mRNA剪接；MCODE_4代表pre-mRNA加工；MCODE_5代表snRNA轉(zhuǎn)錄。結(jié)合DLEU1在多種腫瘤中的共同通路,我們可以發(fā)現(xiàn),DLEU1極有可能通過ncRNA代謝途徑參與膀胱癌的發(fā)展過程。

3 討論

膀胱癌是男性中第四大最常被診斷出的癌癥。超過70%的膀胱癌患者被診斷為非肌層浸潤性疾病。然而,膀胱腫瘤接受膀胱內(nèi)化療(22%)或卡介苗的生物治療(29%)后,50%～70%的病例會出現(xiàn)復(fù)發(fā),10%～20%的病例會侵入固有肌層(T2或更高)[31]。對于肌肉浸潤性疾病,治療方案十分有限。膀胱切除術(shù)和化療聯(lián)合放療是兩種最常見的治療選擇,但長期預(yù)后較差,5年生存率僅為47%。對于合并的所有階段,膀胱癌患者預(yù)期5年生存率為77%,10年生存率為70%。高復(fù)發(fā)和進(jìn)展速率快是膀胱癌治療的主要障礙[32]。確定膀胱癌的新檢測和治療靶點(diǎn)對于開發(fā)進(jìn)一步有效的監(jiān)測和治療至關(guān)重要。

lncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA通過介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄在心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)變性疾病和癌癥等各種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此,了解膀胱癌中l(wèi)ncRNA的機(jī)制可能有助于尋找膀胱癌的有效治療方法。以前的研究表明,包括 MALAT-1、H19、UCA1 在內(nèi)的許多l(xiāng)ncRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移而參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程。DLEU1是一種在B細(xì)胞淋巴瘤等造血系統(tǒng)腫瘤中經(jīng)常缺失的潛在發(fā)揮抑癌作用的lncRNA分子。研究表明,DLEU1通過與miR-490-3p相互作用改變CDK1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[19]；在胃癌中,DLEU1通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制抑制KLF2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖,并可用于預(yù)測胃癌的不良預(yù)后[18]。然而,DLEU1在膀胱癌中的作用仍不清楚。

圖7 DLEU1在100種腫瘤芯片中的共表達(dá)基因及其KEGG富集和PPI網(wǎng)絡(luò)分析(A)腫瘤表達(dá)芯片中DLEU1的共表達(dá)基因熱圖；(B)前200名DLEU1共表達(dá)基因的KEGG分析；(C)前200名DLEU1共表達(dá)基因的PPI分析。Fig.7 DLEU1 co-expressed genes and their KEGG enrichment and PPI analysis in 100 tumor arrays(A)The heatmap of top 200 DLEU1 co-expressed genes in tumor expression chips；(B)KEGG analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes；(C)PPI analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes.

圖8 DLEU1在TCGA-BLCA中的共表達(dá)基因及其KEGG富集和PPI網(wǎng)絡(luò)分析(A)LinkedOmics中DLEU1的共表達(dá)基因熱圖；(B)KEGG分析LinkedOmics中前200名的DLEU1共表達(dá)基因；(C)PPI分析LinkedOmics中前200名的DLEU1共表達(dá)基因。Fig.8 DLEU1 co-expressed genes and their KEGG enrichment and PPI analysis in TCGA-BLCA(A)The heatmap of DLEU1 co-expressed genes in TCGA-BLCA samples；(B)KEGG analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes in LinkedOmics；(C)PPI analysis of top 200 DLEU1 co-expressed genes in LinkedOmics.

本研究采用Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology、Dcode、NCBI、GWAS Catalog[22]、Targetvalidation、FireBrowse、Wanderer、GEPIA、Multi Experiment Matrix、LinkedOmics和Metascape等多種可視化生物信息學(xué)手段,系統(tǒng)全面地研究了DLEU1的染色體定位、物種保守性、多種正常和腫瘤組織中的表達(dá)變化、GWAS相關(guān)表型,并重點(diǎn)研究了其在膀胱癌中的表達(dá)、預(yù)后、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)等。通過Multi Experiment Matrix和LinkedOmics的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),DLEU1極有可能通過調(diào)控ncRNA代謝途徑參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程。需要特別指出的是,以上分析均基于生物信息學(xué)預(yù)測,具有一定的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)意義,但仍需后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,本研究通過多種生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn),DLEU1在膀胱癌中高表達(dá),且與其總體生存率和無病生存率的顯著降低相關(guān),對于后續(xù)深入研究DLEU1對膀胱癌的調(diào)控作用機(jī)制有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

聲明：該研究無影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。